尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究

发布时间：2020-10-02 08:21

　　背景及目的:化疗药物的临床应用常伴随着一系列的不良反应,造成多器官、多系统损伤,严重影响患者的化疗疗效和预后。在泌尿系统,化疗药物导致的损伤主要表现为急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)和出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis,HC),具有代表性的化疗药物分别是顺铂和环磷酰胺。目前临床上针对AKI和HC的治疗手段疗效有限,以间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)应用为代表的干细胞技术为其治疗带来了希望,然而MSCs在泌尿系统的应用仍存在障碍。尿源干细胞(urine-derived stem cells,USCs)是相比于MSCs更适用于泌尿系疾病的种子细胞,USCs及USCs分泌的外泌体(exosomes secreted from urine-derived stem cells,USCs-Exo)在多种泌尿系疾病中具有治疗作用,而在化疗药物导致的AKI、HC等泌尿系损伤中的应用尚缺乏探索。本研究旨在探索USCs及USCs-Exo在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用效果,并初步探讨其机制,为临床治疗这类疾病提供新的思路与参考。方法:第一部分:探索USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用并初步探讨其机制收集6名健康男性的无菌尿液用于USCs的提取及培养。CCK-8实验检测USCs的生长曲线;流式细胞术、免疫荧光检测USCs的表面标志物表达;诱导分化实验检测USCs的多向分化能力;绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)慢病毒转染USCs用于示踪。取30只野生型雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过单次腹腔注射顺铂(5 mg/kg)的方式诱导大鼠AKI模型,模型建立后第1天通过尾静脉注射应用2×10~6 USCs作为治疗。第2、4天各处死1只大鼠,共聚焦显微镜下检测肾组织中GFP标记的USCs,第4天处死所有大鼠,摘眼球取血,取肾组织。血生化检测大鼠血清(serum creatinine,SCr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平;HE及PAS染色观察大鼠肾组织学损伤变化,采用肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比评估大鼠肾组织学损伤程度;透射电镜观察大鼠肾脏超微结构的改变;Ki67免疫组化、TUNEL染色观察大鼠肾组织增殖及凋亡的变化;Western Blot实验检测大鼠肾组织TNF-α、IL-6、NF-κB、BCL-2、BAX、cleaved caspase-3的表达变化。采用梯度浓度的顺铂诱导大鼠肾上皮NRK-52E细胞损伤,CCK-8实验检测顺铂的细胞毒性,流式细胞术检测细胞周期,选取合适的浓度诱导后续细胞损伤模型;细胞模型构建后与USCs共培养,CCK-8实验检测损伤细胞增殖活性的变化、流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。第二部分:探索USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用并初步探讨其机制用去除外泌体的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培养基培养USCs,2天后收集上清,超速离心法提取USCs-Exo,透射电镜观察外泌体形态;粒径分析检测外泌体粒径分布;Western Blot实验检测外泌体标志蛋白。取45只野生型雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过隔日注射1次,共4次的方式腹腔注射80 mg/kg的环磷酰胺诱导小鼠膀胱炎模型。模型建立后的第1天,通过尾静脉注射含100μg总蛋白的USCs-Exo悬液作为治疗,第4天处死所有小鼠取膀胱。HE染色观察膀胱组织学损伤变化,软件测量膀胱上皮厚度及黏膜下层的距离;甲苯胺蓝染色观察膀胱组织肥大细胞浸润变化;Ki67免疫组化观察膀胱黏膜增殖的变化;TUNEL染色观察膀胱黏膜凋亡的变化;扫描电镜观察膀胱黏膜管腔面上皮超微结构改变;Western Blot实验检测膀胱组织中TNF-α、IL-6、IL-10、NOX2、cleaved caspase-3的表达变化;尿动力学实验检测膀胱排尿功能变化。用100 ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导人膀胱上皮SV-HUC-1细胞的炎症模型,用PKH67染色的USCs-Exo与SV-HUC-1共培养,激光共聚焦显微镜下观察LPS诱导的SV-HUC-1对USCs-Exo的吸收;CCK-8实验检测SV-HUC-1细胞增殖活性的变化,划痕实验检测SV-HUC-1细胞迁移能力的变化。提取USCs-Exo及相应USCs中的RNA,small RNA测序探讨可能的机制。结果:1.我们提取的USCs呈指数生长,可快速增殖;表达与MSCs类似的表面标志物CD44、CD73、CD105、CD133;不表达造血干细胞表面标志物CD31、CD34、CD45;表达胚胎干细胞表面标志物SSEA4;表达肾周细胞表面标志物CD146、PDGFRB、NG2;能向平滑肌和上皮细胞分化。在USCs治疗后,大鼠血清BUN、SCr水平显著降低;肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比明显降低;大鼠肾脏超微结构明显改善;肾小管上皮细胞增殖增加、凋亡减少;在第2、第4天均可在肾组织中发现GFP标记的USCs;TNF-α、IL-6、NF-κB、BAX、cleaved caspase-3的表达水平明显降低,BCL-2的表达水平明显升高。梯度浓度的顺铂均可导致NRK-52E细胞增殖活性降低、细胞周期阻滞。选择10μM、20μM诱导体外模型,与USCs共培养后,诱导的NRK-52E细胞增殖活性显著升高、细胞周期阻滞改善,细胞凋亡率显著下降。2.我们提取的USCs-Exo电镜下呈典型的“杯盘状”形态;粒径分布在80~200 nm;表达外泌体标志蛋白CD9、CD63。在USCs-Exo治疗后,小鼠膀胱黏膜上皮厚度减少、黏膜下层距离明显降低;肥大细胞浸润明显减少;黏膜上皮增殖率降低、凋亡率减少;膀胱上皮管腔面的超微结构明显改善;TNF-α、IL-6、cleaved caspase-3及NOX2的表达水平均下降、而IL-10的表达水平升高;小鼠排尿间隔延长、最大排尿压下降。LPS诱导的SV-HUC-1细胞可吸收USCs-Exo,与USCs-Exo共培养后,增殖活性增强、迁移能力增强。small RNA测序提示USCs-Exo中的microRNA可能是其发挥治疗作用的机制所在。结论:1.USCs可通过减轻炎症反应,抑制肾小管上皮细胞凋亡,促进肾小管上皮细胞增殖,从而在体内和体外减轻顺铂诱导的AKI大鼠模型的肾损伤;2.USCs对AKI大鼠模型的治疗作用可能是通过USCs直接向肾组织归巢分化或通过旁分泌方式发挥作用;3.USCs-Exo可通过减轻炎症反应及氧化应激、抑制膀胱上皮细胞的病理性增生及凋亡、及促进膀胱上皮细胞的迁移及分化,从而减轻环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎,促进其排尿功能的恢复;4.USCs-Exo对膀胱炎小鼠模型的治疗作用很可能与其所含有的microRNA有关。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

生长曲线,生长特征,表面标志,标尺

34图 1. USCs 的生长特征。（A）USCs 初始种植第 3 天、第 7 天、P0 代、P3 代及诱导分化为平滑肌、上皮后的细胞形态，标尺：50 μm，100 μm，200 μm；（B）USCs 的生长曲线；（C）流式细胞术检测 USCs 的表面标志物；（D）免疫荧光检测 USCs 的表面标志物，标尺：25 μm。P0 代：原代；P3 代：第 3 代；SMC：smooth muscle cells，平滑肌细胞；UC：urothelial cells，上皮细胞；NC：negativcontrol，阴性对照。

诱导分化,平滑肌,上皮细胞

图 2. USCs 向平滑肌和上皮细胞的诱导分化。（A）向平滑肌细胞诱导分化后，细胞平滑肌标志物（Desmin、Myosin、ASMA、Vimentin）的表达明显增加；（B）向上皮细胞诱导分化后，细胞上皮标志物（UP-Ⅰa、UP-Ⅲ、AE1 /AE3、CK13）的表达明显增加。标尺：25 μm；SMC：smooth musclcells，平滑肌细胞；UC：urothelial cells，上皮细胞；NC：negative control，阴性对照。2.2.2 USCs 改善大鼠肾功能及组织学损伤为评价模型大鼠肾功能的恢复情况，测定各组大鼠血清 BUN 和 SCr 水平。相比于Normal 组，AKI+PBS 组的 BUN 和 SCr 均显著升高（P＜0.001，P＜0.01），而在给予USCs 治疗后，BUN 和 SCr 均下降（P＜0.001，P＜0.01）（图 3C：a，b）。为了确定 USCs 对模型鼠组织学损伤的影响，采用 HE 和 PAS 染色分析大鼠肾的组织形态学改变。在肾髓质中，与 Normal 组相比，可见 AKI+PBS 组出现大量肾小管坏死、管腔扩张、刷状缘丢失、上皮细胞变扁平及管型；而相较于 AKI+PBS 组，AKI+USC组的肾小管损伤明显减轻（图 3A，B：medulla）。采用肾小管损伤评分，结果显示 AKI+PBS

透射电镜,超微结构,透射电镜观察,髓质

损伤数量；（e）PAS 阳性面积比。medulla：髓质；cortex：皮质； tubular injury score：肾小管损伤评分；number of injured glomeruli：肾小球损伤数量；PAS-positive area ratio：PAS 阳性面积比；**P＜0.01；***：P＜0.001。标尺：髓质：40 μm；皮质：20 μm。2.2.3 USCs 改善大鼠肾脏超微结构透射电镜结果显示各组大鼠肾脏超微结构：模型鼠肾脏超微结构明显损害，而经USCs 治疗后，肾脏超微结构得到明显改善（图 4）。在髓质，Normal 组的肾脏超微结构显示近端小管上皮细胞完整，含有丰富的线粒体，细胞器无异常；AKI+PBS 组显示肾小管上皮细胞损伤严重，表现为：线粒体肿胀及嵴中断、核固缩、自噬小体增多等；而AKI+USCs 组肾小管上皮细胞损伤减轻，只显示轻微的线粒体水肿（图 4 medulla）。在皮质，Normal 组显示完整的三层滤过屏障；相反的，AKI+PBS 组表现为内皮水肿及空泡化、足细胞肿胀、系膜细胞增殖伴基质扩张、节段性足突融合等，而 AKI+USCs 组仅表现为少量的系膜基质扩张（图 4 cortex）。

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