基于抗真菌新靶标分泌型天冬氨酸蛋白酶和N-肉豆蔻酰基转移酶优化设计新型小分子抑制剂

发布时间：2020-10-02 09:23

　　真菌感染分为浅表性感染和深部感染。浅表性感染是传播性多发病,经常反复发作,是令患者头痛的顽疾；深部感染近年来发病率逐年增高,严重影响和威胁人类生命健康,已成为免疫缺陷患者(HIV感染者、癌症患者等)致死的重要因素。其中,白念珠菌在侵入性真菌感染中的致死率达20%-40%,且耐药性念珠菌不断出现,给抗真菌治疗带来了新的挑战。目前,针对现有抗真菌靶标的临床药物均存在一定缺陷,如作用于真菌细胞膜脂质的两性霉素B存在严重的肾毒性,作用于羊毛甾醇14a-去甲基化酶的唑类药物耐药性严重等。因此,迫切需要寻找和发现具有全新作用机制、抗菌谱广、无交叉耐药性的新型抗真菌先导化合物。本论文基于抗真菌新靶点分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Secreted aspartic protease 2,Sap2),建立Sap2抑制剂筛选模型,通过虚拟筛选发现了全新结构类型Sap2小分子抑制剂,并在此基础上开展了优化设计、构效关系及体内外抗真菌活性研究。此外,还针对抗真菌新靶标N-肉豆蔻酰基转移酶(N-Myristoyltransferase, NMT),对其抑制剂FTR1335开展了结构优化和构效关系研究。一、新型Sap2抑制剂的虚拟筛选和生物活性研究Sap2活性位点空腔大、柔性强,合理设计小分子抑制剂具有较大的挑战性。采用GOLD软件作为筛选工具,通过基于分子对接的虚拟筛选从Specs数据库中得到45个候选化合物。其中,18个化合物在100 gM时的酶抑制率大于40%。化合物A8、A12、A39和A40等表现出中等或以上强度的抑酶活性,其中化合物A40抑酶活性最佳(IC50=13.78 μM)。通过分子对接和分子动力学模拟,初步阐明了活性化合物的作用模式,发现它们主要通过氢键、疏水和π-π相互作用与Sap2结合。所发现的Sap2抑制剂在体外不具有抗真菌活性,与毒力因子的作用机制相吻合。在线虫真菌感染模型活性测试中,化合物A12和A40显示了优秀的体内抗真菌活性,可作为先导化合物进行优化研究。二、新型噻唑酮类Sap2抑制剂的设计、合成和生物活性研究化合物A40是前期基于虚拟筛选发现的新型噻唑酮类Sap2抑制剂,对其进一步结构优化,共设计合成71个全新结构的噻唑酮类衍生物。构效关系研究表明,位于S1’和S1两个疏水口袋的A、B环具有良好的骨架构成和支撑作用,且苯环上为4-甲基取代时活性表现最佳；C环羧基侧链是发挥活性作用的关键位点,增加了化合物与靶酶的氢键相互作用,使抑酶活性得到显著提高。其中,部分化合物具有较好的抑酶活性(如D7、D8、D12、D14、DD19和D22,IC50值均小于5 pM)。化合物C2和D8对线虫真菌感染模型具有较好的保护作用,与氟康唑效果相当。尤其是化合物D8的抑酶活性达到了nM级(IC50=0.86μM),并在系统性白念菌感染的小鼠模型中有效。化合物D8与氟康唑联合用药后,对氟康唑耐药菌感染的小鼠亦有较好的保护作用,为克服耐药菌感染提供了一种新策略。三、新型三氨基三嗪类Sap2抑制剂的设计、合成和生物活性研究化合物A12是基于虚拟筛选发现的新型三氨基三嗪类Sap2抑制剂,对其进一步结构优化,共设计合成了31个全新结构的衍生物。构效关系研究表明,4位苯环部分引入取代基对化合物抑酶活性有一定影响；而6位侧链引入关键氢键结合基团(-OCH2COOH),化合物抑酶活性显著增强,设计思想得到了分子对接验证。其中,化合物I30抑酶活性最佳(IC50=9.15μM),其对线虫真菌感染模型亦表现出良好的保护作用。四、新型吡唑酮类Sap2抑制剂发现、设计、合成和生物活性研究通过对ChemDiv数据库进行Sap2抑制剂的虚拟筛选,得到了50个候选分子,其中8个化合物在100 μM时的酶抑制率大于40%。化合物J16、J28、J29和J41具有中等强度的抑酶活性,其中化合物J29抑酶活性最佳(IC50=5.04 μM)。在此基础上,设计合成了30个全新结构的吡唑酮类衍生物。构效关系研究显示,A环引入不同取代基对化合物的抑酶活性有一定影响,而B环羧基侧链的引入是保持其活性作用的关键。分子对接结果表明,高活性化合物(化合物K13和K20)在S3口袋形成了新的氢键相互作用,这一发现为吡唑酮类Sap2抑制剂的结构优化和构效关系探讨提供了新的思路。五、新型苯并噻唑类N-肉豆蔻酰基转移酶抑制剂的设计、合成和抗真菌活性研究N-肉豆蔻酰基转移酶可以催化肉豆蔻酰基从肉豆蔻酰CoA转移至真核细胞蛋白或病毒蛋白N端的甘氨酸上,进而形成N-肉豆蔻酰化蛋白。NMT已被确证是白念珠菌和新型隐球菌等临床重要致病真菌繁殖和生存所必须的酶。化合物FTR1335是目前报道的抑酶活性较好的一类NMT抑制剂。本论文进行化合物FTR1335的结构优化和构效关系探讨。通过骨架跃迁设计合成四种结构类型共25个衍生物。其中,化合物N1(MIC80=1μ/mL)、N2(MIC80=1μg/mL)、O1(MIC80=0.125μg/mL)对石膏状小孢子菌的活性均优于氟康唑(MIC80=32μg/mL)。化合物L9和L14在抗真菌活性、抗真菌谱和化合物溶解性方面均得到良好改善,且化合物L14对线虫真菌感染模型效果明显,值得进行深入研究。综上,本论文针对抗真菌新靶标Sap2和NMT开展了新型抑制剂研究。通过基于结构的虚拟筛选,首次发现三种全新结构类型的Sap2抑制剂,并对其进行优化设计、构效关系和体内外抗真菌活性研究,共得到131个新型Sap2抑制剂,部分化合物具有较高抑酶活性,并且在线虫或小鼠模型中显示了优秀的体内抗真菌活性。这些新型Sap2小分子抑制剂可作为先导化合物研发新一代抗真菌药物。通过对NMT抑制剂FTR1335的结构优化,设计合成了25个衍生物,发现了具有良好抗真菌活性的新型NMT抑制剂。本论文的研究结果为发现具有全新作用机制和结构类型的小分子抗真菌药物奠定了基础。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R914
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
前言
第一章分泌型天冬氨酸蛋白酶及其抑制剂研究进展
    一、Sap生物学性质
    二、Sap生物学功能
    三、SAP基因表达
    四、Sap介导的酰胺键水解催化机制
    五、Sap三维结构
    六、Sap与抗真菌治疗
    七、Sap抑制剂
    八、回顾与展望
    九、参考文献
第二章新型Sap2抑制剂的虚拟筛选和生物活性研究
    一、基于分子对接的虚拟筛选
    二、筛选结果和活性测试
    三、作用模式研究
    四、抗真菌活性研究
    五、小结
    六、实验部分
    七、参考文献
第三章新型噻唑酮类Sap2抑制剂的设计、合成和生物活性研究
    一、设计思想
    二、化学合成
    三、Sap2抑制剂抑酶活性的研究
    四、对接研究
    五、线虫真菌感染模型活性研究
    六、系统性白念珠菌感染小鼠模型活性研究
    七、小结
    八、实验部分
    九、参考文献
第四章新型三氨基三嗪类Sap2抑制剂的设计、合成和生物活性研究
    一、设计思想
    二、化学合成
    三、Sap2抑酶活性研究
    四、对接研究
    五、线虫真菌感染模型活性研究
    六、小结
    七、实验部分
    八、参考文献
第五章新型吡唑酮类Sap2抑制剂的发现、设计合成和生物活性研究
    一、对ChemDiv数据库虚拟筛选
    二、筛选结果和活性测试
    三、筛选化合物作用模式研究
    四、吡唑酮类Sap2小分子抑制的设计与合成
    五、吡唑酮类化合物Sap2抑酶活性研究
    六、吡唑酮类化合物对接研究
    七、小结
    八、实验部分
    九、参考文献
第六章新型苯并噻唑类NMT抑制剂的设计合成和抗真菌活性研究
    一、设计思想
    二、化学合成
    三、体外抗真菌活性研究
    四、线虫真菌感染模型活性研究
    五、小结
    六、实验部分
    七、参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
    一、研究论文
    二、申请专利
    三、学术活动与获奖情况
致谢
附录

【参考文献】