IL-6下调腺苷A3受体信号促进胶原性关节炎大鼠Thl7细胞分化的机制研究

发布时间：2020-10-09 00:39

　　类风湿关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫病,滑膜组织为RA的主要炎症靶点,大量炎性细胞浸润到滑膜组织,并产生多种致炎性细胞因子,如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-17等,最终导致成纤维样滑膜细胞(FLS)类肿瘤样异常增生、迁移并获得侵袭性。其中IL-6是非常重要的致炎细胞因子,IL-6水平的增高与疾病的活动、发展以及治疗效果都密切相关,为细胞因子风暴的重要诱导分子。IL-6信号激活诱导辅助性T细胞17(Th17)细胞分化,产生IL-17,为另一个关键的促炎细胞因子,这个级联反应被称为IL-6/IL-17炎性轴,在RA的病理机制中发挥重要的作用。IL-6受体拮抗剂可有效改善RA临床表现,如关节炎症和关节破坏,但可能诱发恶性感染、肿瘤等严重不良反应,限制了其临床应用,因此寻找阻止IL-6促进IL-17等更多促炎细胞因子产生的关键分子靶点,对于自身免疫病包括RA的治疗具有重要意义。已知IL-6与IL-23、转化生长因子-β(TGF-β)共同作用,依赖蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信号转导与活化转录因子3(STAT3)信号通路,诱导幼稚T细胞向Th17分化。近期发现,可诱导环磷腺苷早期阻抑蛋白(ICER)是Th17分化的必要分子,其由环磷酸腺苷(c AMP)-蛋白激酶A(PKA)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)信号通路产生,可促进维甲酸相关孤儿核受体(RORγt)的累积。由于c AMP是G蛋白偶联受体(GPCR)特异性介导的下游信号,在RA病程中,IL-6如何作用于GPCR信号,调节c AMP-ICER,引起Th17的分化尚无报道。有研究显示,腺苷抑制Th17细胞分化,在RA中,腺苷A3受体(A3AR)参与T细胞活化,A3AR为偶联Gαi的GPCR,抑制c AMP-PKA信号,IL-6引起的GPCR信号变化是否通过影响A3AR受体信号来发挥的尚不清楚。A3AR的活性主要受到G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)的负性调节,IL-6对GRK2有无调节作用未见报道。目前公认的GRK2抑制剂为抗抑郁药帕罗西汀,课题组前期研究发现苯磺酰芍药苷(CP-25)也具有GRK2活性抑制作用,并且可以显著抑制关节炎症,减少IL-17产生。因此本课题体外应用IL-6、IL-23、TGF-β诱导Th17细胞分化,观察IL-6对A3AR信号及其调节分子GRK2的影响;体内用IL-6抑制剂和GRK2抑制剂治疗CIA大鼠,观察GRK2抑制剂对CIA大鼠Th17分化的影响,以进一步阐明IL-6促进Th17分化的分子机制及GRK2抑制剂改善大鼠CIA的作用机理,为进一步揭示CIA的病理机制,寻找新的治疗靶点,推动CP-25这一自主知识产权新药的创制提供实验依据。方法:采用磁珠分离纯化Wistar大鼠CD3+T淋巴细胞,流式细胞术观察IL-6、TGF-β、IL-23共同刺激下Th17细胞的分化情况,GRK2及A3AR在T细胞胞质、胞膜表达的变化;体外应用GRK2抑制剂帕罗西汀或A3AR激动剂,观察其对IL-6促Th17细胞分化功能的影响;并以Wistar大鼠建立CIA模型,分别给予IL-6受体(IL-6R)拮抗剂托珠单抗(TCZ)、注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rh TNFR:Fc)或甲氨蝶呤(MTX)治疗14天,以及GRK2抑制剂帕罗西汀、CP-25或MTX治疗14天,记录大鼠整体指标变化,包括全身评分、关节炎指数、关节肿胀数和足爪肿胀度,胸腺和脾脏指数,CCK-8法检测T淋巴细胞活力,流式细胞术检测Th17细胞百分比和GRK2的分布情况,免疫荧光法检测各组大鼠脾脏冰冻切片中A3AR的表达和分布情况。结果:1.IL-6体外刺激对Th17细胞分化的影响。TGF-β和IL-23的基础培养体系中加入IL-6,可显著促进T细胞向Th17细胞分化。2.IL-6体外刺激对CD4+T细胞A3AR和GRK2胞质胞膜表达的影响。IL-6/TGF-β/IL-23刺激与TGF-β/IL-23基础刺激相比,A3AR在CD4+T细胞膜上的表达降低,在胞质的表达明显升高;GRK2在CD4+T细胞膜上的表达升高,在胞质的表达降低。3.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠整体指标的影响。与正常大鼠相比,CIA大鼠出现全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和足爪肿胀度的显著升高,体重较正常组减轻,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可明显改善CIA大鼠的各项临床指标。4.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏、胸腺指数的影响。与正常大鼠相比,CIA大鼠的脾脏指数升高,胸腺指数降低,TCZ和MTX可显著抑制CIA大鼠脾脏指数,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可显著恢复CIA大鼠的胸腺指数。5.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠胸腺T细胞活力的影响。CCK-8检测显示,CIA组大鼠胸腺T细胞活力明显增强,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX体内给药明显降低CIA大鼠胸腺T淋巴细胞活力。6.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏Th17细胞比例的影响。CIA大鼠脾脏Th17细胞比例明显升高,TCZ和MTX体内给药显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞比例,rh TNFR:Fc组Th17细胞比例轻度降低,但没有显著性差异。7.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏GRK2在CD4+T胞质胞膜表达的影响。CIA大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上GRK2表达明显升高,TCZ和MTX体内给药明显降低GRK2在大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上的表达,rh TNFR:Fc给药对其没有明显影响;GRK2在各组大鼠脾脏CD4+T细胞胞质的表达水平无显著性变化。8.IL-6R拮抗剂对Th17细胞中A3AR在胞质的分布情况的影响。脾脏冰冻切片免疫荧光实验显示,CIA大鼠脾组织中Th17细胞的比例明显升高,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可降低CIA大鼠脾脏Th17细胞的比例;脾脏组织A3AR的表达水平各组间无显著性差异;CIA大鼠脾组织中IL-17与A3AR的共定位增多,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX体内给药明显减少脾组织中IL-17与A3AR的共定位。9.A3AR激动剂IB-MECA体外给药对IL-6诱导的Th17分化的影响。IL-6/TGF-β/IL-23体外刺激可促进Th17细胞分化,同时给予A3AR激动剂IB-MECA可阻止Th17细胞的分化。10.帕罗西汀体外给药对IL-6诱导的CD4+T细胞GRK2和A3AR胞质胞膜表达的影响。与基础刺激组相比,IL-6可降低A3AR在CD4+T细胞胞膜的表达,增加其在胞质的分布;与IL-6刺激组相比,同时给予帕罗西汀可显著恢复A3AR在胞膜的表达,减少A3AR在胞质的表达;与基础刺激组相比,IL-6可升高GRK2在CD4+T细胞胞膜的表达,减少GRK2在胞质的表达;与IL-6刺激组相比,同时给予帕罗西汀可降低GRK2的胞膜分布,升高GRK2在胞质的表达。11.帕罗西汀体外给药对IL-6诱导的Th17细胞分化的影响。与基础刺激组相比,IL-6可显著促进Th17细胞的分化,GRK2抑制剂帕罗西汀可明显减弱IL-6/TGF-β/IL-23对Th17细胞分化的诱导作用。12.GRK2抑制剂对CIA大鼠整体指标的影响。与正常组相比,CIA大鼠全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和足爪肿胀度显著升高,体重较正常组减轻,帕罗西汀、CP-25和MTX可有效改善CIA大鼠的上述临床指标。13.GRK2抑制剂对于CIA大鼠脾脏、胸腺指数的影响。与正常大鼠相比,CIA大鼠的脾脏指数升高,胸腺指数降低,帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药可显著降低CIA大鼠脾脏指数,CP-25和MTX可明显恢复CIA大鼠的胸腺指数。14.GRK2抑制剂对CIA大鼠脾脏Th17细胞比例的影响。CIA大鼠脾脏Th17细胞比例明显升高,帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药体内给药显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞比例。15.GRK2抑制剂对CIA大鼠脾脏GRK2在CD4+T细胞胞质胞膜表达的影响。CIA大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜GRK2表达明显升高,帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药明显降低GRK2在大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上的表达;各组大鼠脾脏CD4+T细胞胞质的GRK2分布无显著差异。16.GRK2抑制剂对Th17细胞中A3AR在胞质的分布情况的影响。脾脏冰冻切片免疫荧光实验显示,CIA大鼠脾脏中Th17细胞的比例明显升高,帕罗西汀、CP-25和MTX可显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞的比例;各组大鼠脾脏组织A3AR的表达水平无显著变化;CIA大鼠脾脏细胞中IL-17与A3AR的共定位增强,帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药可明显降低脾脏IL-17与A3AR的共定位。结论:1.IL-6升高CD4+T细胞胞膜上GRK2表达,促进A3AR内吞,抑制其信号转导,是其诱导Th17细胞分化的重要机制之一。2.抑制GRK2活性可减少炎症状态下Th17细胞的分化,是CP-25改善大鼠CIA的重要作用机理。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

脾脏,T淋巴细胞,标准误,比例

安徽医科大学硕士学位论文Th 细胞表达 IL-23 受体（IL-23 receptor, IL-23R），使 Th 细胞对 IL-23 的反应增强，IL-23 可维持 Th17 细胞的稳定并促进其产生 Il-17，发挥致炎作用[27]。因此在本实验中，于 96 孔板每孔加入 1×106个分离纯化的脾脏 T 淋巴细胞。IL-6 组每孔加入IL-6 40 ng/ml、TGF-β 3 ng/ml 和 IL-23 30 ng/ml，诱导 Th17 细胞分化；Control 组每孔加入 TGF-β 3 ng/ml 和 IL-23 30 ng/ml。72 h 后标记 CD4 和 IL-17A，进行流式细胞术检测，结果显示 Control 组 Th17 细胞比例平均为 0.705%，IL-6 组 Th17 细胞比例平均为 1.432%，提示 IL-6 体外刺激可显著升高 Th17 细胞的分化比例（图1C 和 D）。

胞质,标准误,统计分析,细胞

图 2. IL-6 体外刺激对 CD4+T 细胞 A3AR 和 GRK2 胞质胞膜表达的影响（n=3, 均数±标准误）。（A）IL-6 刺激组与 control 组胞膜 A3AR 表达统计分析图。与只给予了 TGF-β和 IL-23 的对照组细胞相比，IL-6 体外刺激可降低胞膜 A3AR 表达；（B）IL-6 刺激组与 control 组胞质 A3AR 表达统计分析图。与 Control 组细胞相比，IL-6 体外刺激可显著升高胞质 A3AR 表达；（C）IL-6 刺激组与 control 组胞膜 GRK2表达统计分析图。与 Control 组细胞相比，IL-6 体外刺激可升高胞膜 GRK2 表达；（D）IL-6 刺激组与 control 组胞质 GRK2 表达统计分析图。与 Control 组细胞相比，IL-6 体外刺激可降低胞质 GRK2 表达。Fig 2. Effect of IL-6 in vitro stimulation on the expression and distribution ofA3AR and GRK2 in CD4+T cells. Comparing with the control group, the expressionof A3AR on the plasma membrane was decreased in CD4+T cells, and was increased inthe cytoplasm with IL-6 stimulation (A, B). Plasma membrane GRK2 expression was

整体指标,拮抗剂,大鼠,标准误

27图 3. IL-6R 拮抗剂对于 CIA 大鼠整体指标的影响（n=6, 均数±标准误）。（A）与正常组大鼠相比，CIA 大鼠全身评分显著升高，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾静脉注射、MTX 灌胃给药可显著改善 CIA 大鼠的全身评分；（B）与正常组大鼠相比，CIA大鼠体重随病程的发展明显降低，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾静脉注射、MTX 灌胃给药可显著升高 CIA 大鼠体重；（C）与正常组大鼠相比，CIA 大鼠关节炎指数呈上升趋势，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾静脉注射、MTX 灌胃给药可显著改善 CIA 大鼠的关节炎指数；（D）与正常组大鼠相比，CIA 大鼠关节肿胀数呈上升趋势，TCZ 和

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