新型抗菌活性氨基酸卟啉光敏剂4I的抗菌活性和细胞毒性的体外研究

发布时间：2020-10-10 01:25

　　 研究目的:(1)评价新型氨基酸卟啉光敏剂4I对临床分离的11种敏感菌株和多重耐药菌株的抗菌活性,并比较4I介导的a PDT对临床分离的同一菌种的多重耐药菌和敏感菌之间的差异;(2)检测4I对Hacat(永生化表皮细胞)及RAW264.7(单核-巨噬细胞)的细胞毒性,为进一步的体内实验提供基础。研究方法:(1)抗菌活性实验依据临床药敏结果选取所需菌株,挑取新鲜菌落制备菌悬液,设置a PDT组(4I+菌液+光照)、避光组(4I+菌液+未光照)、阴性对照组(菌液+纯水+光照)、空白对照组(培养基+纯水+光照)共4组,设8个浓度梯度,最高浓度为62.5μM,最低浓度为0.49μM。二倍稀释法将不同浓度光敏剂与菌悬液避光孵育30min后,除避光组外,其余立即行红色激光照射30min(650nm,6J/cm2),采用涂板计数法评定出4I对不同菌株的MIC和MBC值,计算ED50和ED90浓度;并比较4I对临床分离的同一菌种的多重耐药菌和敏感菌之间的差异;(2)细胞毒性实验培养收集Hacat、RAW264.7,96孔板内接种,实验分为aPDT组(4I+培养基+细胞+光照),避光组(4I+培养基+细胞+未光照)共2组,每组分别设置对照组(培养基+细胞+光照/未光照)、空白组(培养基+CCK8)以及7个不同浓度梯度的药物组,最高浓度为62.5μM,最低浓度为0.98μM,贴壁培养24h后,弃掉上清液,加入二倍稀释法稀释好的药液或新培养基,避光孵育30min,孵育后,a PDT组立即照射30min(参数同抗菌活性实验),避光组同等条件下不接受光照避光静置30min,更换含有CCK-8的培养基100ul/孔(10ul CCK-8:100ul培养基),酶标仪450nm处测量吸光度,记录结果。结果:(1)抗菌活性实验新型氨基酸卟啉光敏剂4I对临床筛选出的11种菌种,除奇异变形杆菌、摩根摩根菌外,其余菌株全部有效,抑菌效果与药物浓度成正比,对革兰氏阳性菌的杀菌效果优于革兰氏阴性菌(P0.01),对于同一菌种的敏感菌和多重耐药菌抑菌效果未见明显差异(P0.05),抑制50%菌种的全部菌株生长的有效抑菌浓度值(ED50)和抑制90%菌种的全部菌株生长的有效抑菌浓度值(ED90)的相应药物浓度分别为0.822μM(95%CI 0.590-1.065μM)和1.947μM(95%CI 1.434-3.612μM);单纯4I避光组,对细菌生长无抑制作用;单纯红色弱激光650nm,能量密度6J/cm2作用下,对细菌生长无抑制作用。(2)细胞毒性实验单纯给予红色激光照射,对Hacat有促进细胞生长作用(P0.001);对RAW264.7生长没有影响(P0.999)。单纯给予光敏剂药物孵育30min,对Hacat有促进生长的作用(P0.05),不同浓度组别之间的促生长作用无明显差异(P0.05);较高浓度组62.5μM至15.6μM对RAW264.7有轻度抑制作用(P0.001),其余浓度组对生长无影响(P0.05)。a PDT后,两种细胞的存活率都明显降低,不同浓度组杀伤作用之间未见明显差异(P0.05),4I介导的a PDT后Hacat和RAW264.7的细胞毒性IC50浓度值为分别为1.846μM(95%CI0±6.416μM)和7.447μM(95%CI 1.110±20.087μM)。结论:(1)新型氨基酸卟啉类光敏剂4I具有高效、广谱的抗菌活性,无细胞毒性,低毒副作用,是一种前景极佳的抗菌光敏剂。(2)4I具有促进细胞生长的作用,因此4I结合红色弱激光的光动力抗菌疗法具有广阔的临床应用前景。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R96
【部分图文】：

法科学院生物工程研究所研制，针对前期实验以改进，以取代的四苯基卟啉为基础，引入性氨基酸卟啉光敏剂：5，10，15，20-四{4-}卟啉，编码缩写为 4I（结构见图 1），通过前期的光热稳定性、亲水性，高细菌吞噬量，高。通过扩大细菌种类，评价光敏剂 4I 对临床直菌活性，并比较 4I 对同一菌种的敏感菌株和异，同时检测 4I 光敏剂对人永生化表皮细胞264.7）的细胞毒性，为进一步体内实验提供

图 2.4I 抗菌活性实验 96 孔板排板图 2 注：A.aPDT 组（4I+菌液+光照）B.避光组(4I+菌液+未光照)C.阴性对照组（菌液+纯水+光照/未光照）D.空白对照组（培养基+纯水+光照）1.1.7 实验步骤①除 62.5μM 浓度组外，每孔加入纯水 100μl。②向 62.5μM 浓度组加入 125μM 药液 200μl/孔，取 100μl/孔加入到下一个

图 3. aPDT 组表皮葡萄球菌 a.4I 光敏剂 15.6～3.9μM 浓度组 b. 4I 光敏剂 1.95～0.975μM 浓度组 c. 4I 光敏剂 0.49μM 浓度组 d.未加 4I 光敏剂的阴性对照组1.2.2 光敏剂 4I 对同一菌种的敏感菌和耐药菌药敏结果比较（表 3）表 3.同一菌种的敏感菌和耐药菌药敏结果比较菌 最小抑菌浓度 最小杀菌浓度株 RSRRMann-Whitney U 值 Z P（双侧）RSRRMann-Whitney U 值 Z P（双侧）革兰氏阳性菌 G+

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