基于Michael加成的核酸芯片基片的制备和表征

发布时间：2020-10-10 03:42

　　目前,商业化生物芯片大部分使用的是硅烷试剂修饰玻片制备的基片,该类基片一致性和稳定性差的问题影响到了生物芯片的使用性能,例如同批次和批次间的重现性。另外,基片还存在化学偶联基团(例如琥珀酰亚胺酯,NHS)易于水解的问题。现有研究多集中在玻片表面的硅烷化和后续化学偶联技术,不能从根本上解决硅烷化反应的不可控性带来的问题。本文选取二乙烯基砜(DVS)代替硅烷试剂进行玻片硅羟基修饰,共价键引入乙烯基砜(VS)偶联基团,制备了一种性能优异的核酸芯片基片。首先,本论文研究了有机碱催化剂、温度、反应物浓度等反应条件对Si-OH修饰反应的影响。结果表明该反应具有很高的可控性,通过改变催化剂、温度和反应物浓度均可以调节VS偶联基团的表面密度。其次,采用Sulfo-Cyanine 3 amine(Sulfo-Cy3-NH_2)荧光分子,基于荧光强度评价了VS基片固定分子的化学反应活性。研究表明,表面VS基团在碱性条件下具有很高反应的活性,且与商业化的醛基基片比较,VS基片具有更高的固定密度。通过改变Sulfo-Cy3-NH_2浓度和反应时间能够获得不同的固定密度。实验表明VS基片在pH≤9和高湿度环境都具有很高的稳定性,且VS基片与玻片同样具有非常低的荧光背景。芯片点样打印实验表明,VS基片适合于接触式点样打印,所制备的样点形状规则,信号均一。然后,将VS基片用于制备核酸芯片,并对核酸固定和杂交性能进行了考评。通过改变核酸探针浓度得到不同密度的核酸芯片,在核酸探针浓度为80μmol/L,芯片核酸探针密度达到2.7±0.1 pmol/cm~2。核酸杂交实验表明,VS基片表面固定的核酸探针具有良好的空间分布,杂交效率达到64.3%,且杂交信号一致性高,检测限达到4×10~(-14)mol/L。将4℃干燥环境长期放置的VS基片用于核酸探针打印,结果表明该类基片在空气中长期稳定。与商业化的NHS基片比较,VS基片也表现出优异的性能。此外,本论文使用双(乙烯基磺酰)甲烷(BVS)制备了一种高反应活性的VS表面,将巯基衍生的甘露糖分子固定于两种VS表面。使用生物膜层干涉(BLI)技术研究固定的巯基甘露糖结合Con A的能力和选择性。综上,本论文基于DVS与硅羟基的迈克尔加成反应制备了一种新型的核酸芯片基片,相比于传统基片具有制备制备过程可控、一致性好、稳定性高的优势。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R91
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 生物芯片概述
    1.2 微阵列杂交型芯片的分类
    1.3 微阵列杂交型芯片的制备
        1.3.1 制备方法
        1.3.2 探针固定方法
    1.4 微阵列杂交型芯片的杂交性能
    1.5 信号检测
    1.6 微阵列生物芯片研究面临的问题
        1.6.1 基片制备的一致性问题
        1.6.2 基片的稳定性问题
    1.7 本文的研究目的和内容
2 乙烯基砜(VS)基片的制备
    2.1 引言
    2.2 实验仪器与试剂
    2.3 实验操作
        2.3.1 硅片的清洗
        2.3.2 催化剂筛选
        2.3.3 温度筛选
        2.3.4 DVS浓度筛选
        2.3.5 X射线光电子能谱(XPS)表征
        2.3.6 VS基片的制备
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 催化剂筛选
        2.4.2 温度的影响
        2.4.3 DVS的浓度筛选
        2.4.4 X射线光电子能谱(XPS)表征
        2.4.5 VS基片的制备
    2.5 小结
3 乙烯基砜(VS)基片的性能
    3.1 引言
    3.2 实验仪器与试剂
    3.3 实验操作
        3.3.1 VS基片表面化学反应活性
        3.3.2 VS基片在不同pH条件下的稳定性
        3.3.3 高湿度环境对VS基片稳定性的影响
        3.3.4 VS基片的光学性能
        3.3.5 VS基片封闭试剂筛选
        3.3.6 VS基片点样实验
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 VS表面化学反应活性
        3.4.2 VS基片在不同pH溶液中的稳定性
        3.4.3 高湿度环境对VS基片稳定性的影响
        3.4.4 VS基片的光学性能
        3.4.5 封闭试剂的筛选
        3.4.6 VS基片的点样实验
    3.5 小结
4 核酸芯片的制备和表征
    4.1 引言
    4.2 实验仪器与试剂
    4.3 实验操作
        4.3.1 探针的固定
        4.3.2 样品杂交实验
        4.3.3 核酸芯片的检测限
        4.3.4 核酸芯片的选择性
        4.3.5 VS基片长时间放置后的探针固定性能
        4.3.6 NHS基片对照实验
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 探针固定实验
        4.4.2 样品杂交实验
        4.4.3 基因芯片的检测限
        4.4.4 核酸芯片的选择性
        4.4.5 VS基片的长期稳定性
        4.4.6 商业的NHS基片对照实验
    4.5 小结
5 糖芯片的制备和表征
    5.1 引言
    5.2 试剂和仪器
    5.3 实验操作
        5.3.1 VS化表面的制备
        5.3.2 糖的合成和固定
        5.3.3 基于生物膜层干涉(BLI)技术的选择性研究
        5.3.4 基于生物膜层干涉(BLI)技术的杂交性能研究
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 VS化表面的制备
        5.4.2 糖的合成和固定
        5.4.3 基于生物膜层干涉(BLI)技术的选择性研究
        5.4.4 基于生物膜层干涉(BLI)技术的杂交性能研究
    5.5 小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢

【相似文献】