罗格列酮对高糖微环境下H9c2心肌细胞的影响

发布时间：2020-10-16 23:31

　　 目的:考察不同浓度葡萄糖对H9c2心肌细胞增殖活性和氧化应激的影响,构建体外高糖微环境。研究罗格列酮(RSG)对高糖微环境下H9c2细胞氧化应激、能量代谢和细胞凋亡的影响。方法:(1)构建体外高糖微环境:将含有不同浓度葡萄糖培养基处理的心肌细胞分别培养24 h、48 h和72 h,利用倒置显微镜观察心肌细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)法检测心肌细胞活性,酶标法检测还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量,四唑盐(WST-1)法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力,流式细胞法检测活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)和转化生长因子(TGF-β1)。(2)筛选RSG浓度及时间:采用MTT法测定不同浓度RSG作用24 h、48 h和72 h对高糖微环境下H9c2心肌细胞活性的影响,倒置显微镜观察细胞形态变化,确定RSG体外心肌实验的低、中、高浓度及最佳作用时间。(3)RSG对细胞的影响:RSG低、中、高浓度作用高糖微环境下H9c2心肌细胞48 h后,检测GSH、MDA含量和SOD活力,流式细胞法检测ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,罗丹明123(Rh-123)检测心肌细胞线粒体膜电位(MMP),反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测心肌细胞中ATP、ADP和AMP含量。结果:(1)33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖组作用心肌细胞24 h后,与正常葡萄糖组(25 mmol·L~(-1))比较,细胞活性、SOD活性和GSH含量均明显降低(P0.05),而ROS水平明显升高(P0.05),MDA含量升高,炎症因子TNF-a、TGF-β1的浓度均显著增加(P0.05)。33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖、24 h是抑制细胞增殖形成氧化应激的浓度和时间折点。(2)MTT实验结果,RSG处理心肌细胞48 h能获得良好的抑制规律曲线(R~2=0.9861,IC_(50)为456.31μmol·L~(-1)),因此确定48 h为处理时间。筛选得到RSG作用48 h的低、中、高浓度分别为340.00μmol·L~(-1)、450.00μmol·L~(-1)和560.00μmol·L~(-1)。与对照组(5.56 mmol·L~(-1))比较,RSG使细胞GSH含量减少、SOD活力降低,MDA含量增加,ROS水平升高;MMP和线粒体内5’-三磷酸腺苷(ATP)含量显著降低,5’-二磷酸腺苷(ADP)和5’-磷酸腺苷(AMP)含量显著升高,心肌细胞凋亡率明显增加,具有统计学意义(P0.05)。(3)ATP、ADP和AMP的RP-HPLC分析方法:Agilent ZORB-AX SB-C_(18)柱(4.6mm×150 mm,5μm),流动相为0.2 mol·L~(-1)磷酸盐缓冲液(含0.805 g四丁基溴化铵)∶甲醇=95∶5,柱温35°C,流速1 mL·min~(-1),紫外检测波长258 nm。ATP、ADP和AMP的保留时间分别为11.8 min、7.5 min和4.3 min。ATP、ADP和AMP分别在0.75~48μg·mL~(-1)、0.50~32.00μg·mL~(-1)、0.25~16.00μg·mL~(-1)范围内线性关系良好。ATP、ADP和AMP的最低定量限(LLOQ)分别为0.75μg·mL~(-1)、0.50μg·mL~(-1)和0.25μg·mL~(-1)(S/N=10);平均提取回收率在65.28%~81.08%范围内,日内相对标准偏差(RSD)、日间RSD和稳定性RSD均15%。结论:(1)高糖微环境是抑制心肌细胞增殖,诱导细胞氧化应激的重要因素。33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖作用H9c2心肌细胞24 h是构建体外高糖微环境的最佳浓度与时间。(2)研究建立了能同时测定ATP、ADP和AMP含量的RP-HPLC分析方法,精密度、准确度符合要求且稳定性良好。(3)RSG浓度大于340.00μmol·L~(-1)可能通过影响心肌细胞氧化应激、能量代谢,诱导细胞凋亡产生心肌损害作用。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

图 1-2 正常培养的 H9c2 细胞Fig.1-2 The H9c2 cells of normal culture的复苏：①37 C 水浴预热培养基；②从液氮 5 mL DMEM 高糖培养基（添加 10% 胎牛血重悬细胞，离心 5 min（1000 rpm）；④弃上后转入 T25培养瓶中；⑤置于 37 C、5% CO胞的传代：①当细胞贴壁生长汇合至≥80%覆 3 遍，胰酶消化；②观察到细胞变圆，有细轻轻吹散细胞，离心 5 min（1000 rpm）；④ 1:3 的比例传代；⑤于细胞培养箱中孵育 24胞的冻存：①取对数生长期的细胞，弃培养；②观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁

图 1-3 二极管阵列检测器检测能量物质 3D 扫描图Fig.1-3 The 3D chart of energy substances by diode array detector 溶液的配制备液的配制别精密称取 ATP、ADP 和 AMP 对照品 20.0 mg、10.0 mg 和 10.0 mg溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，分别得浓度为2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mg·mL-1的 ATP、ADP 和 AMP 对照品储备液，再稀释成不同浓度的。作液的配制标准曲线工作液的配制：以超纯水为溶剂，按表 1-4，表 1-5，表 1-6 DP和AMP标准曲线工作液（Working solution preparation of standard cS1~WS7，将配制好的标准曲线工作液 4 C 避光保存。

细胞边缘界限清楚；培养 48 h细胞（图 2-1，A-2）伸出伪足交织成网，融合度增高；继续培养至 72 h 细胞（图2-1，A-3）基本融合，形态变为圆形或椭圆形。2.1.1.2 低浓度葡萄糖组心肌细胞形态低浓度葡萄糖组（5.56 mmol·L-1）培养心肌细胞 24 h（图 2-1，B-1），细胞大小不规则，细胞间隙较宽；继续培养至 48 h（图 2-1，B-2），部分细胞变圆，细胞边缘开始模糊；培养至 72 h（图 2-1，B-3）
【参考文献】

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本文编号：2843931