PLGA纳米颗粒负载人肝素酶疫苗体外抗肿瘤的实验研究

发布时间：2020-10-18 03:15

　　 目的:制备并探讨肝素酶(Heparanase,Hpa)纳米疫苗对肿瘤的杀伤效果。方法:1.在体外合成肝素酶单肽(Hpa)、4分支肽(MAP)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒,用PLGA包埋这两种肝素酶抗原肽,构建PLGA包埋的肝素酶纳米疫苗。2.用密度梯度离心法从健康人外周血中提取人单个核细胞(PBMCs),并将其分为单核细胞和淋巴细胞。用细胞因子GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和TNF-α(20ng/ml)将单核细胞诱导成为树突状细胞(dendritic cells,DCs),用于吞噬、提呈抗原;淋巴细胞用纳米疫苗及IL-2刺激成为效应细胞,即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),用于杀伤靶细胞。3.体外培养胃癌细胞株SGC-7901(Hpa+,HLA-A2-)、KATO-III(Hpa+,HLA-A2+),乳腺癌细胞株MCF-7(Hpa-,HLA-A2+)、BT-549(Hpa+,HLA-A2+),自身淋巴细胞和DC作为靶细胞,用蛋白质印迹法(western blot)检测四种肿瘤细胞中肝素酶的含量。4.为研究该纳米疫苗是否能成功刺激淋巴细胞成为CTL,将纳米疫苗与淋巴细胞共培养,期间加入IL-2促进T细胞活化,共刺激结束后用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)释放量。5.为研究该纳米疫苗诱导的CTL对肝素酶及HLA-A2双阳性的肿瘤细胞是否具有广泛性,以CTL为效应细胞、KATO-III和BT-549为靶细胞共培养后,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL对上述两种靶细胞的杀伤效应。6.为研究该纳米疫苗诱导的CTL是否具有Hpa特异性,以CTL为效应细胞、MCF-7为靶细胞共培养后,用LDH释放法检测CTL对该靶细胞的杀伤效应。7.为研究该纳米疫苗诱导的CTL是否具有HLA-A2特异性,以CTL为效应细胞、SGC-7901为靶细胞共培养后,用LDH释放法检测CTL对该靶细胞的杀伤效应。8.为研究该纳米疫苗的安全性,以CTL为效应细胞、自身DC和淋巴细胞为靶细胞共培养后,用LDH释放法检测CTL对这两种靶细胞的杀伤效应。9.实验数据以?x±s表示,采用SPSS 19分析实验结果,P0.05有统计学意义。结果:1.成功合成肝素酶单肽Hpa(KMLKSFLKA)和该单肽合成的4分支肽,其纯度分别为97.91%和84.37%。2.成功合成直径为105.5nm的PLGA纳米颗粒,用其包埋Hpa和MAP,包埋后的粒径分别为111.3nm和121.2nm。3.用western blot检测4种肿瘤细胞中肝素酶的含量,结果显示为SGC-7901、KATO-III和BT-549细胞中肝素酶为阳性,而MCF-7细胞中肝素酶为阴性。4.成功从外周血分离出单核细胞,并用其诱导为成熟DC,采用流式细胞术分析DC表型结果显示,CD1α、CD80、CD83和HLA-A2均符合成熟DC表型,其阳性率分别为85.4%、88.7%、90.1%和93.2%。5.我们采用ELISA法检测不同的纳米疫苗诱导的效应细胞分泌FN-γ量结果显示,PLGA纳米疫苗包埋的MAP疫苗(PLGA-MAP)及PLGA-Hpa纳米疫苗产生的FN-γ量明显高于MAP组、Hpa组、PLGA组和空白对照组。6.效应细胞对肝素酶和HLA-A2双阳性的KATO-III和BT-549肿瘤细胞均有显著的杀伤效应;对肝素酶阴性而HLA-A2阳性的MCF-7和肝素酶阳性而HLA-A2阴性的SGC-7901细胞没有杀伤效应。7.效应细胞对子自身的淋巴细胞和DC均没有杀伤效应。结论:1.成功制备100nm左右的PLGA-MAP肝素酶纳米疫苗。2.PLGA-MAP纳米疫苗可以刺激效应细胞产生IFN-γ非特异性杀伤肿瘤细胞。3.PLGA-MAP纳米疫苗诱导的效应细胞对恶性肿瘤具有良好的杀伤效应,其具有肝素酶特异性并且受HLA-A2限制。4.PLGA-MAP纳米疫苗诱导的效应细胞对自身淋巴细胞和树突状细胞无杀伤效应,其安全性良好。5.PLGA-MAP纳米疫苗对HLA-A2和Hpa双阳性的KATO-III胃癌细胞和BT-549乳腺癌细胞均具有杀伤效应,其具有广泛抗肿瘤的特点。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【文章目录】：
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Application of multifunctional nanomaterials in cancer vaccines(综述)
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本文编号：2845722