促胰岛祖细胞分化为胰岛素分泌型细胞的高通量模型的建立及化合物筛选
发布时间：2020-10-19 20:38
促进胰岛祖细胞分化为新的β细胞,有望从根本上解决胰岛β细胞损伤和数量减少的问题。因此,寻找新的分化诱导剂促进胰岛再生,对于有效缓解和治疗糖尿病具有重要意义。胰腺十二指肠同源框-1(PDX-1)在胰岛形成、自细胞分化及功能维持中具有至关重要的作用。本课题以PDX-1为目的基因构建高通量筛选模型,筛选出了能促进PDX-1表达,进而促进胰岛祖细胞分化为胰岛素分泌型细胞的化合物。首先,体外诱导PANC-1分化为胰岛样细胞团,该细胞团能表达胰岛特异基因,且葡萄糖刺激后能分泌胰岛素,移植到I型糖尿病小鼠肾包膜后,小鼠血糖可恢复到正常水平。表明,我们建立了将胰岛样祖细胞分化为胰岛细胞的方法。其次,运用蛋白免疫印迹法(WB)和免疫荧光法研究了 PDX-1在PANC-1细胞分化不同时间点的表达和分布。发现PDX-1主要在PANC-1细胞分化初期高表达并入核;而过表达PDX-1,可促进PANC-1分化及成熟。表明,PDX-1对PANC-1细胞分化具有重要作用。再次,以PDX-1为目的基因构建高通量筛选模型,筛选出能促进PDX-1表达的植物粗提物C754。运用液相色谱质谱联用和高效液相色谱法鉴定出C754中的主要组分为C1037,即穿心莲内酯。qPCR和WB研究C1037的活性,发现C1037可浓度依赖性上调PDX-1表达。最后,C1037作用于PANC-1细胞后,检测分化不同时间点胰岛特异基因的表达,以及胰岛样细胞团对葡萄糖刺激的胰岛素分泌。结果显示,C1037能加速PANC-1细胞分化为胰岛样细胞团(ILCCs),并促进ILCCs对葡萄糖刺激的胰岛素分泌。说明C1037能加速PANC-1细胞分化过程,为临床治疗糖尿病提供了新的候选分化诱导剂。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：
出生后不久，内分泌胰腺通过涉及大量细胞凋亡和细胞复制的过程进行重构。??在成人中，正常情况下细胞的转换率较低，借助（至少在啮齿类动物中）细胞死??亡（通过细胞凋亡）与现有细胞的复制维持平衡（如图１．３），这一结论通过使用??胰岛素启动子驱动的Ｃｒｅ重组酶［１１８］的体内谱系示踪技术和基于ＤＮＡ类似物的??谱系示踪技术［１１９］得到证实。??然而，Ｐ细胞总体数量可以通过调节以补偿随着年龄和妊娠而增加的代谢需??求，以及对抗与肥胖相关的胰岛素抵抗反应。Ｐ细胞生长和增殖的调节主要通过??经ＩＲＳ－２调控的胰岛素／ＩＧＦ信号传导。因此，自细胞中ＩＲＳ－２基因失活的小鼠由??于细胞增殖减少和细胞凋亡增加而导致３细胞衰竭。鉴于ＰＤＸ－１在胰腺发育，??细胞分化以及在成熟０细胞中基因表达的重要性，其被认为是维持成人充足的健??康０细胞池的主要参与者。在Ｐｄｘｌ减少５０％的小鼠中，分离的胰岛在基础葡萄??糖浓度下更易于凋亡，并且随着年龄的增长，其维持Ｐ细胞数量的能力下降。??Ｐｄｘｌ的功能可能由胰岛素／ＩＧＦ信号途径通过叉头转录因子Ｆｏｘｏｌ调节。??１２??
为了研究胰岛样细胞团是否能在体内发挥生理活性，我们在模型小鼠肾包膜??下移植正常胰岛细胞（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ）或分化后的胰岛细胞团，定时监测小鼠??血糖水平。如图２．２?Ｂ所示，空白对照组小鼠血糖一直稳定在８ｍＭ左右；假手??术组小鼠血糖在手术后无明显变化，证明手术过程并不会对小鼠血糖值造成影响；??阳性对照组，即移植正常胰岛细胞，小鼠血糖显著下降，恢复正常水平，证明胰??岛细胞经肾包膜移植入小鼠体内后仍能存活且能正常发挥生理活性；实验组，即??移植分化后的胰岛样细胞团，小鼠血糖也显著降低，恢复到正常血糖水平。??移植５天后，将阳性对照组和实验组小鼠颈椎脱臼处死，取出移植后的肾组??织，经石蜡包埋，切片后进行ＨＥ染色和免疫荧光染色，观察移植入小鼠肾包膜??下的胰岛样细胞团的状态。如图２．２Ｃ所示，移植后的胰岛样细胞团均匀分散在??肾组织上
根据荧光值大小计算各粗提物的增强率。如图４．１?Ｂ所示，横坐标??代表不同植物粗提物，纵坐标代表增强率，增强率大于零代表粗提物增强ＰＤＸ－??１启动子活性，小于零代表粗提物抑制ＰＤＸ－１启动子活性。??我们选取增强率较大，离散值较高的１１个粗提物，ＰＣＲ初步检测其对ＰＤＸ－??ｌｍＲＮＡ水平是否具有增强效应。如图４．１?Ｃ所示，粗提物刺激２４ｈ后，提取细??胞总ＲＮＡ检测ＰＤＸ－１的表达，发现Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７相较于??对照组对ＰＤＸ－１的表达有些微增强作用。??为了进一步验证Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７的活性，我们用ｗｅｓｔｅｒｎ??ｂｌｏｔｔｉｎｇ?检测了?Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７?对于?ＰＤＸ－１?蛋白水平上的调节??作用。如图４．１?Ｄ所示，Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７均能明显促进ＰＤＸ－１的表达，??说明我们构建的高通量筛选模型不仅能实现同时对多个化合物进行筛选，且筛选??结果具有参考性。由于Ｃ７５４上调ＰＤＸ－１表达的能力最强，固我们选取Ｃ７５４作??为候选化合物进行后续实验。??Ａ?Ｓｒ＇ｔｈｃｔｉ：?ｐｏｉｙｔＡ?Ｂ??
【参考文献】
本文编号：2847699
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：
出生后不久，内分泌胰腺通过涉及大量细胞凋亡和细胞复制的过程进行重构。??在成人中，正常情况下细胞的转换率较低，借助（至少在啮齿类动物中）细胞死??亡（通过细胞凋亡）与现有细胞的复制维持平衡（如图１．３），这一结论通过使用??胰岛素启动子驱动的Ｃｒｅ重组酶［１１８］的体内谱系示踪技术和基于ＤＮＡ类似物的??谱系示踪技术［１１９］得到证实。??然而，Ｐ细胞总体数量可以通过调节以补偿随着年龄和妊娠而增加的代谢需??求，以及对抗与肥胖相关的胰岛素抵抗反应。Ｐ细胞生长和增殖的调节主要通过??经ＩＲＳ－２调控的胰岛素／ＩＧＦ信号传导。因此，自细胞中ＩＲＳ－２基因失活的小鼠由??于细胞增殖减少和细胞凋亡增加而导致３细胞衰竭。鉴于ＰＤＸ－１在胰腺发育，??细胞分化以及在成熟０细胞中基因表达的重要性，其被认为是维持成人充足的健??康０细胞池的主要参与者。在Ｐｄｘｌ减少５０％的小鼠中，分离的胰岛在基础葡萄??糖浓度下更易于凋亡，并且随着年龄的增长，其维持Ｐ细胞数量的能力下降。??Ｐｄｘｌ的功能可能由胰岛素／ＩＧＦ信号途径通过叉头转录因子Ｆｏｘｏｌ调节。??１２??
为了研究胰岛样细胞团是否能在体内发挥生理活性，我们在模型小鼠肾包膜??下移植正常胰岛细胞（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ）或分化后的胰岛细胞团，定时监测小鼠??血糖水平。如图２．２?Ｂ所示，空白对照组小鼠血糖一直稳定在８ｍＭ左右；假手??术组小鼠血糖在手术后无明显变化，证明手术过程并不会对小鼠血糖值造成影响；??阳性对照组，即移植正常胰岛细胞，小鼠血糖显著下降，恢复正常水平，证明胰??岛细胞经肾包膜移植入小鼠体内后仍能存活且能正常发挥生理活性；实验组，即??移植分化后的胰岛样细胞团，小鼠血糖也显著降低，恢复到正常血糖水平。??移植５天后，将阳性对照组和实验组小鼠颈椎脱臼处死，取出移植后的肾组??织，经石蜡包埋，切片后进行ＨＥ染色和免疫荧光染色，观察移植入小鼠肾包膜??下的胰岛样细胞团的状态。如图２．２Ｃ所示，移植后的胰岛样细胞团均匀分散在??肾组织上
根据荧光值大小计算各粗提物的增强率。如图４．１?Ｂ所示，横坐标??代表不同植物粗提物，纵坐标代表增强率，增强率大于零代表粗提物增强ＰＤＸ－??１启动子活性，小于零代表粗提物抑制ＰＤＸ－１启动子活性。??我们选取增强率较大，离散值较高的１１个粗提物，ＰＣＲ初步检测其对ＰＤＸ－??ｌｍＲＮＡ水平是否具有增强效应。如图４．１?Ｃ所示，粗提物刺激２４ｈ后，提取细??胞总ＲＮＡ检测ＰＤＸ－１的表达，发现Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７相较于??对照组对ＰＤＸ－１的表达有些微增强作用。??为了进一步验证Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７的活性，我们用ｗｅｓｔｅｒｎ??ｂｌｏｔｔｉｎｇ?检测了?Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７?对于?ＰＤＸ－１?蛋白水平上的调节??作用。如图４．１?Ｄ所示，Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７均能明显促进ＰＤＸ－１的表达，??说明我们构建的高通量筛选模型不仅能实现同时对多个化合物进行筛选，且筛选??结果具有参考性。由于Ｃ７５４上调ＰＤＸ－１表达的能力最强，固我们选取Ｃ７５４作??为候选化合物进行后续实验。??Ａ?Ｓｒ＇ｔｈｃｔｉ：?ｐｏｉｙｔＡ?Ｂ??
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 ;Reversal of hyperglycemia in diabetic rats by portal vein transplantation of islet-like cells generated from bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2007年24期
2 ;Nestin-positive progenitor cells isolated from human fetal pancreas have phenotypic markers identical to mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年19期
本文编号：2847699
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