基于核受体Nur77的抗肿瘤化合物的筛选及其机制的研究
发布时间：2020-10-19 22:28
核受体Nur77,也称为TR3或NGFI-B,是NR4A1编码的立早基因产物,在细胞增殖、分化、代谢、凋亡以及自噬等生物学进程中发挥重要作用。临床研究表明,Nur77在很多的癌症组织中高表达,如胰腺癌,结肠癌,膀胱癌等,这也预示着Nur77可能的促增殖功能;同时,Nur77还能够通过出核定位线粒体并引起细胞色素C释放的机制诱导肿瘤细胞的凋亡。Nur77在肿瘤细胞中的特殊功能使其成为肿瘤药物开发中一个潜在的靶点。mTOR属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员,在哺乳动物细胞中广泛存在。研究表明,mTOR信号通路的过度激活与众多癌症进程密切相关,如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。本课题旨在筛选以Nur77为靶点的抗肿瘤先导化合物,并对其机制进行探究。首先,我们从大量化合物中筛选得到三种对胃癌细胞有很好的杀伤作用且结构类似的吲哚类衍生物7n、7s、7w,生物学功能研究发现它们能够抑制胃癌细胞增殖并促进胃癌细胞凋亡。接着,通过对化合物的抗肿瘤机制研究发现,化合物7s一方面能够诱导Nur77的表达,出核以及线粒体定位进而启动细胞凋亡;另一方面,化合物7s还能够抑制对细胞生存非常重要的mTOR信号通路的激活。有趣的是,本论文还发现化合物7s对mTOR信号通路的抑制作用依赖于核受体Nur77的表达。最后,我们通过体外纯化Nur77的配体结合域(LBD)蛋白,并进行等温热量滴定(ITC)和荧光滴定实验,证明化合物7s能够与Nur77的LBD区结合。因此,本论文通过对吲哚杂环系列化合物的筛选,发现化合物7s能够靶向Nur77发挥抗肿瘤作用。通过机制的初步探讨,发现化合物7s一方面通过Nur77的出核和线粒体定位介导细胞凋亡,另一方面通过Nur77依赖的方式抑制与细胞生存相关的mTOR信号通路的激活。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914
【部分图文】：
图４．?ｍＴＯＲ复合体结构图??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍＴＯＲ?ｃｏｍｐｌｅｘ．??ｍＴＯＲ有很多磷酸化位点，其中丝氨酸２４８１位是其自磷酸化位点，这一位??点的磷酸化能够监控ｍＴＯＲ特异性的催化活性［１Ｇ８］。此外，生长因子等还能够引??起ｍＴＯＲ其它位点的磷酸化。众多研宄表明，ｍＴＯＲ相应位点的磷酸化能够增??加ｍＴＯＲ的活性并且对于ｍＴＯＲＣｌ的功能有重要影响Ｌ＂２】。有趣的是，Ｃｏｐｐ??等人发现ｍＴＯＲ丝氨酸２４８１位的磷酸化可以作为完整ｍＴＯＲＣ２复合体的一个??生物标记，因为在ｍＴ０ＲＣ２中丝氨酸２４８１位是显著磷酸化的，而ｍＴＯＲＣｌ中??丝氨酸２４４８位是显著磷酸化的［１１３】。细胞中，ｍＴＯＲＣｌ和ｍＴ０ＲＣ２信号通路的??上下游存在显著差异，发挥的功能也各不相同。本论文中所用的ｐ－ｍＴＯＲ抗体主??要检测Ｓｅｒ２４４８。??５．?２?ｍＴＯＲ
Ｆｉｇｕｒｅ?６．?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．将一定数量的三种胃癌细胞铺于９６孔细胞培养板中，密度合适后用含１％血清的培??养基加药处理４８?ｈ，然后加入ＭＴＴ溶液，继续培养处理４?ｈ后收样，检测。根据０Ｄ值变化??求出细胞生存率并用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５软件作图；Ｂ．在六孔板中铺适量细胞（５００个／孔），??待细胞培养２４?ｈ后开始加药处理，用含１０％血清的培养基加药，加药浓度均为２?ｎＭ，培养??基四天更换一次，继续培养，直至克隆清晰可见，然后吸去培养基，固定并用结晶紫染色??１０?ｍｉｎ，洗净后拍照。??２．２吲哚类衍生物７ｎ、７ｓ、７ｗ诱导胃癌细胞的凋亡??细胞内的ＰＡＲＰ?（Ｐｏｌｙ?ＡＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）蛋白在早期阔亡的时候会产??生切割，因此可以作为细胞早期凋亡的标志。我们采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法，通??过检测ＰＡＲＰ切割来确定化合物诱导细胞凋亡的情况。首先我们分别检测了?７ｎ、??７ｓ、７ｗ三个化合物在ＳＧＣ－７９０１、ＨＧＣ－２７以及ＢＧＣ－８２３三种胃癌细胞中诱导凋??
Ｆｉｇｕｒｅ?８．?Ｃｏｍｐｏｕｎｄ?７ｓ?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＧＣ－７９０１?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．?ＳＧＣ－７９０１细胞铺于六孔板中，密度合适后用无菌的白色枪头划痕拍照，然后用含１％??血清的培养基加药，使其终浓度为５?＿，处理４８?ｈ后再拍照。Ｂ．统计图。??３．?７ｎ、７ｓ和７ｗ诱导Ｎｕｒ７７的表达??首先，在ＳＧＣ－７９０１细胞系中，我们采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，检测化合物对Ｎｕｒ７７??的ｍＲＮＡ水平的影响。结果发现，化合物能够显著的上调Ｎｕｒ７７的ｍＲＮＡ水平??（图９Ａ）。接着我们通过Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法检测了化合物对Ｎｕｒ７７蛋白表达的??影响。同样在ＳＧＣ－７９０１细胞系中，分别５?ｐＭ用的７ｎ、７ｓ、７ｗ处理细胞０．５?ｈ、??ｌｈ、３?ｈ、５?ｈ、７?ｈ，然后用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ检测Ｎｕｒ７７蛋白表达的变化。结果表明，??化合物７ｎ、７ｓ、７ｗ能够诱导Ｎｕｒ７７的蛋白的表达，其中７ｓ的诱导作用最明显。??并且在３－５?ｈ时，Ｎｕｒ７７的上调作用最明显（图９Ｂ）。接着我们又做了一个浓度??
【参考文献】
本文编号：2847801
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914
【部分图文】：
图４．?ｍＴＯＲ复合体结构图??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍＴＯＲ?ｃｏｍｐｌｅｘ．??ｍＴＯＲ有很多磷酸化位点，其中丝氨酸２４８１位是其自磷酸化位点，这一位??点的磷酸化能够监控ｍＴＯＲ特异性的催化活性［１Ｇ８］。此外，生长因子等还能够引??起ｍＴＯＲ其它位点的磷酸化。众多研宄表明，ｍＴＯＲ相应位点的磷酸化能够增??加ｍＴＯＲ的活性并且对于ｍＴＯＲＣｌ的功能有重要影响Ｌ＂２】。有趣的是，Ｃｏｐｐ??等人发现ｍＴＯＲ丝氨酸２４８１位的磷酸化可以作为完整ｍＴＯＲＣ２复合体的一个??生物标记，因为在ｍＴ０ＲＣ２中丝氨酸２４８１位是显著磷酸化的，而ｍＴＯＲＣｌ中??丝氨酸２４４８位是显著磷酸化的［１１３】。细胞中，ｍＴＯＲＣｌ和ｍＴ０ＲＣ２信号通路的??上下游存在显著差异，发挥的功能也各不相同。本论文中所用的ｐ－ｍＴＯＲ抗体主??要检测Ｓｅｒ２４４８。??５．?２?ｍＴＯＲ
Ｆｉｇｕｒｅ?６．?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．将一定数量的三种胃癌细胞铺于９６孔细胞培养板中，密度合适后用含１％血清的培??养基加药处理４８?ｈ，然后加入ＭＴＴ溶液，继续培养处理４?ｈ后收样，检测。根据０Ｄ值变化??求出细胞生存率并用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５软件作图；Ｂ．在六孔板中铺适量细胞（５００个／孔），??待细胞培养２４?ｈ后开始加药处理，用含１０％血清的培养基加药，加药浓度均为２?ｎＭ，培养??基四天更换一次，继续培养，直至克隆清晰可见，然后吸去培养基，固定并用结晶紫染色??１０?ｍｉｎ，洗净后拍照。??２．２吲哚类衍生物７ｎ、７ｓ、７ｗ诱导胃癌细胞的凋亡??细胞内的ＰＡＲＰ?（Ｐｏｌｙ?ＡＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）蛋白在早期阔亡的时候会产??生切割，因此可以作为细胞早期凋亡的标志。我们采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法，通??过检测ＰＡＲＰ切割来确定化合物诱导细胞凋亡的情况。首先我们分别检测了?７ｎ、??７ｓ、７ｗ三个化合物在ＳＧＣ－７９０１、ＨＧＣ－２７以及ＢＧＣ－８２３三种胃癌细胞中诱导凋??
Ｆｉｇｕｒｅ?８．?Ｃｏｍｐｏｕｎｄ?７ｓ?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＧＣ－７９０１?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．?ＳＧＣ－７９０１细胞铺于六孔板中，密度合适后用无菌的白色枪头划痕拍照，然后用含１％??血清的培养基加药，使其终浓度为５?＿，处理４８?ｈ后再拍照。Ｂ．统计图。??３．?７ｎ、７ｓ和７ｗ诱导Ｎｕｒ７７的表达??首先，在ＳＧＣ－７９０１细胞系中，我们采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，检测化合物对Ｎｕｒ７７??的ｍＲＮＡ水平的影响。结果发现，化合物能够显著的上调Ｎｕｒ７７的ｍＲＮＡ水平??（图９Ａ）。接着我们通过Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法检测了化合物对Ｎｕｒ７７蛋白表达的??影响。同样在ＳＧＣ－７９０１细胞系中，分别５?ｐＭ用的７ｎ、７ｓ、７ｗ处理细胞０．５?ｈ、??ｌｈ、３?ｈ、５?ｈ、７?ｈ，然后用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ检测Ｎｕｒ７７蛋白表达的变化。结果表明，??化合物７ｎ、７ｓ、７ｗ能够诱导Ｎｕｒ７７的蛋白的表达，其中７ｓ的诱导作用最明显。??并且在３－５?ｈ时，Ｎｕｒ７７的上调作用最明显（图９Ｂ）。接着我们又做了一个浓度??
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 王维嘉;王渊;吴乔;;核受体TR3/Nur77与肿瘤治疗[J];中国细胞生物学学报;2015年05期
2 ;Induction of apoptosis by TPA and VP-16 is through translocation of TR3[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期
本文编号：2847801
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yiyaoxuelunwen/2847801.html
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