三株土壤放线菌次级代谢产物的研究

发布时间：2020-10-21 18:33

　　 土壤放线菌能够产生多种多样的具有生物活性的天然产物,是抗生素的重要来源。其中,安莎霉素类抗生素是一类以3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)为起始单元的结构独特的大环内酰胺类化合物,具有良好的生物活性,故而从土壤放线菌中挖掘具有成药潜力的新型安莎霉素成为我们的研究目标。AHBA合酶是安莎霉素类化合物合成的关键酶,且AHBA合酶基因在不同的菌株中具有高度保守性,本课题组的宋任泰博士从全国各地的土壤中以AHBA合酶基因为靶向进行PCR筛选得到80株AHBA合酶基因阳性菌株。本研究论文以其中的三株AHBA阳性菌Streptomycessp.S051、Streptomyces sp.S006和Streptomycessp.S035为研究材料,对其次级代谢产物进行了系统的研究。运用葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)、中压液相相柱层析(RP-18)、硅胶柱层析(Silica gel)以及高效液相色谱(HPLC)等多种技术,共分离得到了 29个化合物,并利用紫外(UV)、红外(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)和X-ray单晶衍射等技术鉴定了其结构,其中12个为新合物,包括1个萘醌类化合物,4个萜类化合物和7个五酮安莎霉素类化合物。对菌株Streptomycessp.S051的固体YMG培养基发酵产物进行提取分离和结构鉴定,共得到8个化合物,其中1个新的萘醌类化合物A13(4),未得到安莎霉素类抗生素,推测安莎霉素基因簇在此株菌中低表达或者不表达。对菌株Streptomyces sp.S006的固体Waksman培养基发酵产物进行提取分离和结构鉴定,共得到7个化合物,包括4个新的萜类化合物(B12、B13、B4和B6,12-15)并对其进行了抗菌活性的测定,化合物均未显示出明显活性。本次分离未得到安莎霉素类化合物,推测安莎霉素基因簇在此株菌中低表达或者不表达。对菌株Streptomyces sp.S035安莎霉素基因簇中的正调控因子LAL和SARP进行共表达构建了突变株S035-SL。对突变株Streptomyces sp.S035-SL的固体燕麦基发酵产物进行提取分离和结构鉴定,共得到14个化合物,包括7个结构新颖的五酮安莎霉素(SL31、SL27、SL14、SL6、SL8、SL12 和 SL13,16-22)。选取HeLa、SW480、PC3和HCT116四株癌细胞对化合物16-22进行了细胞毒性测定,其中化合物SL6、SL27和SL14均显示出了细胞毒作用,SL8和SL12对不同细胞株具有选择性抑制作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R915
【部分图文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｔｙｐｉｃａｌ?ａｎｓａｍｙｃｉｎｓ??安莎霉素类抗生素是从植物或者微生物体内分离得到的一类大环内酰胺类??抗生素（图１．１），其结构特征是共同的前体化合物３－氨基－５－羟基苯甲酸（ＡＨＢＡ）??３５，ＡＨＢＡ的生物合成是ａｍｉｎｏＤＨＳ在ＡＨＢＡ合酶特异性的催化下生成的（图??１．２，图片１．２引自参考文献４Ｇ），因此ＡＨＢＡ合酶基因被用作系统发育标记的特??定基因来定位新的安莎霉素。根据其生物合成中聚酮链的延伸次数，已发现的安??莎霉素类抗生素可以分为５酮、７酮、８酮、９酮、１１酮和１４酮，但是６酮、１０??酮、１２酮、１３酮和大于１４酮的安莎霉素尚未发现。通过扩增ＡＨＢＡ合成酶基??因中的简并引物来筛选ＡＨＢＡ阳性菌株３６＿３７。由己知序列和ＰＣＲ扩增子序列构??建了系统发育树，根据它们的安莎霉素亚家族揭示了?ＡＨＢＡ合酶基因的分支３６??（图１。２）。除了安沙霉素类抗生素外，根据系统发育树还分析得到了小单孢菌属??中含ＡＨＢＡ的杂合ＰＫＳ－ＮＲＰＳ基因簇的进化枝，以及ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ基因簇中ｍｉｔＡ??序列形成的进化枝３７。通过优化培养基

?ＬＣ６中，过表达正调控因子得到了?２个结构新颖的五酮安沙霉素ｊｕａｎｌｉｍｙｃｉｎｓ?Ａ??和Ｂ?３８?（图１．２）。在另一株链霉菌ＬＺ３５中过表达特异性转录调节因子（ｎａｍｌ），??成功地激活沉默的安沙霉素基因簇并得到了新的安莎霉素ｎｅｏａｎｓａｍｙｃｉｎｓ?Ａ－Ｃ?３９??（图?１．２）。??ＣＯＯＨ?ＣＯＯＨ??Ｉ?ＡＨＢＡ?ｓｙｎｔｈａｓｅ??｜〇〇?ｓ蓝織?ｎ?〇ｊｈ〇＾ｎｈ２??，〇°?”溫〇Ｈ?ＡｈｂＡ??：防，＇Ｖ二，一?ａｍｉｎｏＯＨＳ?；??．〇〇?ｗ?／?ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ??Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ?ｓｐ．?ＬＣ６??，ｍ?ＪｕａｎｌｌｍｙｄｎＡ?Ｒ＝??二二＿ｉ；?？ｆｉ＝：ｎ?ｒＨ??＇?ｖ＾：．Ｉ?ＨＯＯＣ＾＾Ｏ?ｊｕａｎｌｉｍｙｃｉｎＢ?Ｒ?＝??００??？?〇Ｈ?ｒ?ｊ?＼?，??ｒ＊Ａ?ｎ?ｖ＊４ｉｉ＇Ｈ??Ｖ，?１Ｉ．Ｘ５０４８７Ｓ）???１００?Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ?ｓｐ．?ＬＺ３５??晰说獅＝?？?Ｈ?＾?？?？?ｎ??￣?；￣ｒ?咖洲邮納?ｒｒ＼ｒ?ｒｒＶＹ??＂?ｔａ３?加？如丨Ａｈｗ丨产?Ｈｏ＾Ｓ－＾＾ｃｙＳｒＲ??（Ａｉｘ?Ｍｕｎ?ａｅｔＫｆｉ＊４?ｒ?Ｕ＾？ｖｗｗａｗ?ｔｐｆ?Ｉ?ＪＬ?／?ｉ??＜?＞＂ｙ＇?？？ｉ?－?ｉＶｕｈｆ????，Ｋ?啊－—?ｎｅ〇８ｎＳａｍｙＣｍＡ?－＾ｎ＾ｍｙｃｎＢ?Ｒ

与Ｃ－１２ａ存在ＨＭＢＣ相关信号，Ｈ－１２ｂ与Ｃ－６ａ，?Ｃ－１２ａ存在ＨＭＢＣ相关信号以及??角甲基质子Ｍｅ－１４，?Ｍｅ－］５与Ｃ－５，?Ｃ－４ａ处存在ＨＭＢＣ信号，通过ＨＭＢＣ信号将??结构连接起来（图３．３）。经数据库检索和核磁数据对比，化合物Ａ７为己知化合??物?ｎａｐｈｔｈｇｅｒａｎｉｎｅ?Ａ４４＿４６〇??Ｈ。滅‘：??ＯＨ?〇??图３．３化合物Ａ７?（１）重要的ＣＯＳＹ和ＨＭＢＣ相关信号??Ｆｉｇｕｒｅ?３．３?Ｋｅｙ?ＣＯＳＹ，?ＨＭＢＣ?ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?Ａ７?（１）??（见电子版文件夹Ｓ０５１）??表?３．１．化合物?Ａ７?（１）的?ＮＭＲ?数据（４００?ＭＨｚ，?ｄｉｎ?ｐｐｍ，＾?ｉｎ?Ｈｚ）??Ｔａｂｌｅ?３．１．?Ｔｈｅ?ＮＭＲ?ｄａｔａ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄ?Ａ７?（１）?（４００?ＭＨｚ，?Ｊｉｎ?ｐｐｍ，?Ｊ?ｉｎ?Ｈｚ）??（见电子版文件夹Ｓ０５１）??Ｐｏｓ．?ｄＨ?Ｓｃ?＇Ｈ－＇Ｈ?ＣＯＳＹ?ＨＭＢＣ??１?５．９９?（ｄ，?４．２）?１２０．７ｄ?Ｈ－１２ｂ，?Ｍｅ－１３?Ｃ－２，?Ｃ－３，?Ｃ－４ａ，?Ｃ－１３??２?１３５．６ｓ??３?１．９７?（ｍ）?２９．６ｔ?Ｈ－４?Ｃ－ｌ，Ｃ－４，?Ｃ－１３??４?１．１８?（ｍ）?２０．３ｔ?Ｈ－３?Ｃ－３，?Ｃ－４ａ??１．８９?（ｍ）?Ｃ－２，?Ｃ－４ａ??４ａ?１．８０?（ｍ）?３９．Ｉｄ?Ｈ－ｌ
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 殷瑜;戈梅;陈代杰;;新方法新技术与新型抗生素发现[J];微生物学通报;2013年10期

2 何庆;李青连;王丽非;洪斌;;基于微生物基因组的新型天然产物发现策略[J];国际药学研究杂志;2012年01期

3 赵世萍;章育中;;葛根中异黄酮含量的薄层光密度法测定[J];药学学报;1985年03期

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1 张治强;八株土壤放线菌次级代谢产物的研究[D];山东大学;2017年

本文编号：2850460