纳米系统应用于内耳递送的体内外摄取及跨圆窗膜转运机制研究

发布时间：2020-10-26 08:46

　　 近年来,纳米系统应用于治疗内耳疾病的研究发展迅速。圆窗膜作为物质进入中耳到内耳的生物膜屏障,使大部分药物难以渗透到圆窗膜进入内耳中,从而难以达到治疗效果。因此研究纳米系统跨圆窗膜的转运机制为提高转运效率及治疗内耳疾病非常重要。但是,目前关于纳米系统从中耳转运到内耳的过程、以及体内外的转运行为的了解还很欠缺,认识纳米系统与圆窗膜相互作用机制仍然存在很大挑战。本文通过对纳米系统在体内外生物相容性与摄取转运机制的研究,期望为纳米系统在内耳疾病治疗中的应用提供参考及借鉴。前期研究已经合成基于CMCS/CC-CS纳米粒与mPEG-PLGA纳米粒相互作用形成的复合型纳米粒,具有多重响应、双药载药联合治疗等优点,但该纳米粒以及该类型的复合型纳米粒应用于内耳递送的研究非常匮乏。将分别包载尼罗红、香豆素-6的CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒作为递送系统,对其体内外生物相容性、体内外摄取分布规律进行了研究。体外细胞毒性及摄取结果表明在小于20 mg/mL浓度范围内,CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒表现出轻微的细胞毒性,能被HEI-OC1细胞有效摄取,围绕着细胞核分布,且呈现出一定的时间、浓度依赖性。利用斑马鱼模型研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒的胚胎毒性及摄取情况,结果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒使斑马鱼胚胎的发育提前,并且这种影响具有浓度依赖性。斑马鱼摄取结果表明斑马鱼的侧线毛细胞能够有效的摄取CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒。以豚鼠为实验动物模型,研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒在内耳组织的生物相容性及分布规律。通过苏木精-伊红染色评价CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒用于内耳给药的安全性,均表现出良好的生物相容性。体内分布结果表明经局部给药后,CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒能够有效被前庭组织中的感觉毛细胞及耳蜗组织中的感觉毛细胞摄取,且前庭组织的摄取量显著大于耳蜗组织。为了更深入研究纳米递送系统在内耳分布规律的机制,以豚鼠圆窗膜为模型考察了CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒对圆窗膜的通透性情况。采用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察,发现香豆素-6的绿色荧光与尼罗红的红色荧光在圆窗膜中广泛分布,说明该纳米粒可以进入圆窗膜。使用透射电子显微镜观察经局部纳米粒给药后收集的外淋巴液,结果显示纳米粒经局部给药后以完整的形式进入到外淋巴液。选用1.7 mg/mL、5 mg/mL及15 mg/mL三个浓度点对纳米粒跨圆窗膜进行浓度依赖性考察,结果表明纳米粒在圆窗膜内的荧光强度呈现出一定的浓度依赖性。选用了15 min,30 min及60 min三个时间点,对CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒跨圆窗膜进行时间依赖性考察,结果表明0-30 min,纳米粒在圆窗膜内的荧光强度随着时间的增加而增加,但是在30-60 min,纳米粒在圆窗膜的荧光强度随着时间的增加而降低。为了研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒跨圆窗膜的转运机制,使用透射电子显微镜对鼓室注射CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒30 min后的豚鼠圆窗膜进行观察。与正常对照组相比,纳米粒处理组的圆窗膜外上皮细胞及内上皮细胞发现了大量囊泡,圆窗膜的外上皮细胞的紧密连接增宽,结果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒通过跨细胞及细胞旁路途径进入圆窗膜。紧接着为了探究跨细胞途径的具体机制,使用不同的内吞抑制剂、细胞内转运抑制剂进行研究。结果表明CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒主要以网格蛋白、小窝蛋白、巨胞饮介导的多种内吞方式进入圆窗膜,随后进入到溶酶体中,最后经内质网及高尔基体介导的胞吐排出细胞进入到外淋巴。圆窗膜作为物质从中耳进入到内耳的途径,但同时是阻止物质进入内耳的生物膜屏障。低分子量鱼精蛋白(LMWP)作为一种细胞穿膜肽,能够介导生物大分子及纳米粒穿过生物膜,为纳米粒克服生物膜屏障提供了一种新思路。将LMWP修饰在PLGA纳米粒表面上,研究该递送系统应用于内耳给药的体内外行为。细胞毒性实验结果表明,LMWP修饰的PLGA纳米粒具有较低的细胞毒性,仅在高浓度时(≥2000μg/ml),LMWP修饰的PLGA纳米粒才显示出不可忽略的细胞毒性作用。细胞摄取实验结果显示,经LMWP修饰的PLGA纳米粒在HEI-OC1细胞的摄取显著高于未经修饰的PLGA纳米粒,且LMWP修饰的PLGA纳米粒在30min、180min在细胞核有明显的分布。在体内动物实验中,经局部给药后,使用小动物活体荧光成像定量分析发现LMWP可以促进纳米粒进入耳蜗。接下来对纳米粒在圆窗膜的分布进行了考察,结果表明LMWP可以促进纳米粒进入圆窗膜,同时发现用罗丹明B标记的LMWP仅在圆窗膜的外上皮层有分布,而香豆素-6标记的PLGA纳米粒在圆窗膜总体上都有分布。紧接着使用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察发现未修饰PLGA纳米粒与LMWP修饰PLGA纳米粒在耳蜗感觉毛细胞的分布无明显差异性。综上所述,本课题系统的研究CMCS/CC-CS@mPEG-PLGA纳米粒在体内外的生物相容性和摄取分布规律,并且阐明该纳米粒跨圆窗膜的转运机制,为提高转运效率及治疗内耳疾病具有重要的理论指导意义。对于LWMP修饰PLGA纳米粒应用于内耳给药,能有效增加体内外的摄取与分布,为优化内耳递送系统的设计提供参考,同时为获得更佳的穿过生物膜屏障效率提供重要的研究基础。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943
【部分图文】：

图 1-1 耳的结构[3]耳疾病是指发生在耳蜗、前庭、听神经等部位的病理性变化，常见耳聋、耳鸣、眩晕[4]。感音性听力损失约占发生耳聋病例的 90%，蜗或者听神经部位发生病理变化引起。感音性听力损失分为噪音性老年性性听力损失、药源性听力损失和梅尼埃病。正常人长时间暴中，往往容易引起噪声性听力损失[5]；其损伤机制为在强噪音的刺耳血流量以及供氧能力发生变化，降低了抗氧化酶和自由基清除

鼓室内给药方式仍需经过圆窗膜屏障，所以耳蜗内直接注射方式比鼓室内给药方式有效，但往往会显著提高耳蜗相关疾病的危险。在大多数情况下，局部药物递送使内耳中的药物浓度最大化，同时减少药物副作用。由于这种“药代动力学优势”，局部给药系统正成为治疗内耳疾病最常用的临床治疗方法[24]。1.2 纳米递送系统在内耳疾病治疗中的应用通过药物递送来治疗内耳疾病面临着很多挑战，比如药物进入中耳腔后，部分药物通过咽鼓管流失，导致进入内耳的药物浓度大大减少。另一方面，由于圆窗膜的低渗透性，也会阻碍药物进入内耳。这些障碍往往导致达到内耳的药物浓度相对低，达不到治疗效果。纳米粒可由不同材料制备形成，通常直径从几十到几百纳米，可以用来包载各种药物[25]。纳米粒具有增加药物溶解度、增加药物的稳定性、控制药物的释放和表面修饰用于特定的靶向作用等优势[26]。如图 1-2，目前已经开发出许多用于内耳药物递送的纳米系统，包括脂质核/壳纳米粒、聚合物和共聚物、超顺磁性氧化铁纳米粒、脂质体等[27]。纳米粒应用于内耳给药已经被证明可以通过圆窗膜成功的将生物材料递送至内耳中，但遗憾的是，靶向性纳米粒的研究却有限[28-30]。

图 1-3 细胞穿膜肽进入细胞三种可能的机制[56]圆窗膜作为物质进入中耳到内耳途径，但同时是阻止物质进入内耳的生物膜屏障。如图 1-4，圆窗膜由 3 层结构构成，包括外上皮层、中间纤维层、内上皮层[57]。外上皮层主要为上皮细胞，细胞之间排列非常紧密，是构成圆窗膜屏障的的主要结构。由于圆窗膜的结构，药物在圆窗膜的渗透率低，从而导致药物进入到内耳的浓度非常低而常常达不到疗效。
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本文编号：2856777