新型经皮光动力药物5-氨基酮戊酸己酯醇质体的制备及其药效学的实验研究

发布时间：2020-10-31 18:38

　　研究背景光动力疗法(Photodynamictherapy,PDT)是一种联合光、光敏剂和组织中氧分子,使用特定波长的激发光照射聚集在人体组织的光敏剂,在组织氧参与下发生光化学反应并产生大量单态氧和自由基,进而对组织或其间的病原微生物选择性杀伤以达到治疗目的的技术。PDT因具有微创、疗效确切和避免口服给药的系统副作用等众多优点而在临床上日益受到重视和广泛应用。PDT除了常用于尖锐湿疣的治疗外,目前在其它疾病的治疗应用上也取得了确切疗效,如:痤疮[1]、银屑病[2]、皮肤肿瘤[3]、甚至是皮肤美容[4]。5-氨基酮戊酸(Aminolevulinic acid hydrochloride,ALA)是第二代卟啉类光动力药物,临床应用中具有疗效好、选择性高的等优点,相对于其他光动力药物,皮肤刺激小、耐受性好,不易形成瘢痕,不影响重要组织器官的功能易愈合和无耐药性,因此它已成为一些皮肤病药物治疗的重要手段[5,6]。5-氨基酮戊酸作用机制为药物经皮渗透后,经一系列酶促作用产生强光敏作用的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)而发挥药效,但实际应用中,5-氨基酮戊酸存在以下问题:ALA由于稳定性不佳而需现用现配;目前在临床上所用凝胶等剂型和ALA本身亲水性的性质,易导致其经皮渗透性不够理想而需要长时间的封包;药物由于无法有效进入皮肤而严重影响临床治疗效果并造成大部分药物的浪费,这些问题已经严重影响ALA在皮肤光动力治疗上的临床应用。经皮药物传递系统,因为能避免肝脏首过效应、肝肾毒性、胃肠道反应等问题,从而有效提高生物利用度,但经皮药物传递系统在实际应用中经常遇到药物难以吸收或吸收缓慢的问题,尤其是对于大分子药物的经皮吸收就更为困难,近年来新型速释型经皮给药载体成为解决以上问题的希望,包括:纳米乳、聚乳酸(PLA)等多聚物纳米粒和脂质固体纳米粒等。但是,在促进药物经皮渗透的同时,它们均因为自身缺陷得不到有效解决而无法真正应用到临床,如:纳米乳制备无法避免添加高达≥30%浓度的表面活性剂,这存在潜在皮肤刺激性;某些多聚物成分应用于不同的皮肤会出现不同反应,也就是说在安全性方面无法得到充分保证;固体脂质纳米粒稳定性不够理性等[7]。醇质体是具有脂质双分子层结构的囊泡,由Touitou于2000年首次提出[8],醇质体可包裹药物经皮渗透,是一种稳定性好、包封率高的新型经皮载体,并具有较好的皮肤屏障穿透性、无毒和无刺激等优点,因此,醇质体具备成为经皮光动力药物载体的条件。ALA极性和不稳定性是造成其经皮渗透和临床应用不佳的重要原因,近些年,ALA衍生物的研发成为一个重要突破方向,目前,已经成功研发出一些新的衍生物,如5-氨基酮戊酸己酯(HLA)和5-氨基酮戊酸甲酯(MLA)等。相关研究显示ALA酯类衍生物较ALA更为稳定,酯溶性也显著优于ALA,尤其是在皮肤中它较ALA可以产生更多的PpⅨ,这意味着更低的药量就能在组织中产生相等治疗量的PpⅨ,从而大大减少药物使用量、降低PDT治疗成本和减少治疗副作用的产生[9]。本研究将较ALA亲酯性更高的HLA和醇质体相结合构建HLA醇质体,它有望为临床提供一种起效更快、副作用更少的新型光动力药物。研究目的研发新型的经皮光动力药物HLA醇质体,并对其药效学进行实验研究和评价。研究方法通过 CLSM 法分析 5-氨基酮戊酸己酯(Hexylaminolevulinate hydrochloride,HLA)、5-氨基酮戊酸(Aminolevulinicacidhydrochloride,ALA)和 5-氨基酮戊酸甲酯(Methylaminolevulinate hydrochloride,ML A)在皮肤中产生 PpⅨ的效能;采用Box-Behnken效应面法筛选出制备HLA醇质体最优配方;通过外观、粒径、包封率和载药率等对HLA醇质体的理化性质和质量控制方法进行研究;通过在体分析以及活体动物药效学实验对所制备的HLA醇质体药效学进行研究。研究结果1.光动力药物一HLA产生PpⅨ的效能研究CLSM观察的平均荧光强度可视为不同时间三种药物透皮后产生PpⅨ的量,三种药物给药2h和4h时,HLA均显著优于MLA和ALA(P0.01),MLA和ALA则无明显差异(P0.05)。三种药物对银屑病小鼠进行两次光动力治疗后,HE组织学染色可以发现HLA组的棘层细胞较MLA和ALA组薄,而免疫组化显示HLA组中IL-6的表达较MLA和ALA组少。这表明HLA光动力治疗银屑病小鼠的效果显著于MLA和ALA。2.HLA醇质体制备及其质量控制研究以最小粒径为指标进行筛选,采用DesignExpert 8.0软件,得出HLA醇质体的最优处方:无水乙醇体积分数比31.31%,大豆磷脂质量体积比为3%,超声时间为3min(97.5W)。筛选最优工艺方案中的归一值取值为0.994,即预测值接近目标值。HLA醇质体外观呈透明淡蓝色液体,透射电镜下观察呈形态较均一的圆形或椭圆形结构。平均粒径为80.87±1.82nm,分散系数为0.31±0.032。包封率为 38.63±0.003%,载药率为 82.85±0.004%。3.HLA醇质体的在体实验给药1、2、3和4h时,0.5%HLA醇质体组的平均荧光强度与0.5%ALA和5%ALA水溶液组相比均有显著统计学差异(P0.05)。4.HLA醇质体的药效评价研究HE染色组织学结果显示0.5%HLA醇质体组的棘层细胞较0.5%ALA和5%ALA组薄;免疫组化组织学结果显示0.5%HLA醇质体组中IL-6的表达较0.5%ALA 组和 5%ALA 组少(P0.05)。研究结论1.光动力药物效能研究表明:HLA较MLA和ALA在组织中能产生更多的PpⅨ;在银屑病小鼠治疗实验中,HLA的治疗效果较MLA和ALA显著;2.HLA醇质体的制备工艺显示,Box-Behnken效应面法筛选出来的最优处方与预设目标处方结果相符,证实该方法的可靠性和有效性;3.HLA醇质体的理化性质和质量控制研究表明,HLA醇质体为粒径小、均一,淡蓝色透明液体,包封率高,稳定性好;4.HLA醇质体的在体实验表明:0.5%HLA醇质体的经皮渗透能力较0.5%ALA和5%ALA强;5.HLA醇质体经银屑病动物模型的药效研究结果表明:0.5%的HLA醇质体的治疗效应较0.5%ALA和5%ALA组更为显著。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R943;R96
【部分图文】：

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无明显的鳞屑和增厚，第３天开始出现鳞屑，轻度增厚，红斑继续加重，第??４天至第６天红斑加重、鳞屑增多和皮肤增厚，第７天红斑加重、皮肤增厚，但??是鳞肩较第６天减少，见图５－１?（Ｆｉｇｕｒｅ?５－１）。??，ｊ?｜Ｊｌ?ｊ??Ｉ．?Ｉｌｌ??图５－１银屑病建模图片??标注：图片中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ分别表示空白组、外涂咪喹莫特后第１、２、３、４、??５、?６、?７天??Ｆｉｇｕｒｅ?５－１?ｐｓｏｒｉａｓｉｓ?ｍｏｄｅｌｉｎｇ?ｐｉｃｔｕｒｅ??Ｎｏｔｅｓ：?Ａ，?Ｂ，?Ｃ，?Ｄ，?Ｅ，?Ｆ，?Ｇ?ａｎｄ?Ｈ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｐｉｃｔｕｒｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｂｌａｎｋ?ｇｒｏｕｐ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ，??ｓｅｃｏｎｄ，ｔｈｉｒｄ，?ｆｏｕｒｔｈ，?ｆｉｆｔｈ，?ｓｉｘｔｈ?ａｎｄ?ｓｅｖｅｎｔｈ?ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ａｐｐｌｙｉｎｇ?ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ．??５．２评估银屑病模型模型??正常小鼠表皮和真皮的交界规则、无炎性细胞浸润，银屑病模型小鼠表皮??增厚和角化过度伴角化不全、棘层细胞肥厚向下突出和炎性浸润，可见Ｍｕｎｒｏ??微脓肿，显示建模成功结果见图５－２?（Ｆｉｇｕｒｅ?５－２），免疫组化可看出银屑病小鼠??模型的棕黄色染色区域较正常小鼠皮肤大，见图５－３?（Ｆｉｇｕｒｅ５－３），银屑病小鼠??１０??

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（ＦｉｇＵｒｅ５－４），统计学有显著差异性，这表明ＩＬ６与银肩病有明显相关性。??遍夢省、：．．．．，??图５－２ＨＥ染色（２００Ｘ）??标注：图中Ａ：正常小鼠皮肤Ｂ：银屑病模型小鼠皮肤??Ｆｉｇｕｒｅ?５－２?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ（２００Ｘ）??Ｎｏｔｅｓ：Ａ：?Ｎｏｒｍａｌ?ｍｏｕｓｅ?ｓｋｉｎ?Ｂ：?Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ?ｍｏｄｅｌ?ｍｏｕｓｅ?ｓｋｉｎ??－－ｖ?；??…ｉ?．ｖ?．．?？??图５－３免疫组化（２００?Ｘ）??１１??

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