ELB对乳腺癌的抗血管生成及生长抑制作用研究

发布时间：2020-11-01 19:06

　　 乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤,其发病率逐年上升,且呈现出年轻化趋势,严重危害着女性的健康。目前,药物疗法(化疗)仍是乳腺癌的主要治疗方法,但化疗药物在治疗时会降低患者的血小板含量。因此,寻找一种既抑制乳腺癌生长又不影响血小板水平的药物至关重要。研究发现肿瘤的生长和转移依赖于新生血管为其提供氧气和营养物质,通过抑制肿瘤的血管生成是治疗肿瘤的有效策略。同时在肿瘤微环境中,大量存在的巨噬细胞能释放多种促血管生成因子,进而促进肿瘤的血管生成,故可寻找通过巨噬细胞抑制血管生成的药物。艾曲波帕(Eltrombopag,ELB)是一种促血小板生成素受体激动剂,用于慢性免疫性血小板减少症的治疗。研究证明ELB具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,但其抑制肿瘤生长及潜在的作用机制尚不明确。故本课题探讨ELB是否能够通过抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,且能维持血小板的水平。具体研究内容如下:1、ELB对乳腺癌细胞系4T1增殖及血管生成相关因子的抑制作用。首先通过MTT实验检测ELB对不同肿瘤细胞的抑制作用,发现ELB对4T1细胞的抑制作用最显著。其次通过q-PCR方法检测ELB对4T1细胞血管生成相关因子mRNA的表达,来进一步探讨ELB是否抑制肿瘤细胞的血管生成,结果显示:ELB能够抑制4T1细胞血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达,且在20μM时抑制作用最显著。2、ELB通过巨噬细胞(Raw264.7)介导的体外抗血管生成作用研究。通过MTT实验、q-PCR方法和ELISA检测ELB对Raw264.7细胞增殖、血管生成相关因子mRNA的表达及VEGF蛋白释放的影响。结果显示:ELB抑制Raw264.7细胞的增殖呈剂量依赖性,抑制Raw264.7细胞血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达和VEGF蛋白的释放。为了进一步探讨ELB通过巨噬细胞对下游血管内皮细胞(HUVEC)功能的影响,将ELB(10μM)作用于巨噬细胞24 h后制备巨噬细胞上清液,然后作用于HUVEC,通过MTT实验、细胞划痕实验、成管实验检测其对HUVEC功能的影响,同时检测ELB直接作用对HUVEC功能的影响。结果发现:ELB作用于巨噬细胞24 h后的上清显著抑制HUVEC的增殖、迁移和小管形成,但ELB直接作用HUVEC不影响其增殖、迁移和小管形成。表明ELB可通过巨噬细胞介导抑制血管生成。3、ELB体内抑制肿瘤生长。构建4T1乳腺癌模型,将小鼠分为阴性对照组(生理盐水)、ELB低剂量组(75 mg/kg)、ELB中剂量组(150 mg/kg)、ELB高剂量组(185 mg/kg)和阳性对照组(吉西他滨75 mg/kg),考察给药后小鼠的肿瘤体积、瘤重、抑瘤率、体重和血小板的变化。结果发现:不同剂量的ELB均能抑制肿瘤的生长,且ELB高剂量组(185 mg/kg)对肿瘤的抑制作用比吉西他滨组(75 mg/kg)更显著;ELB各剂量组均能将小鼠血小板维持在正常水平,而吉西他滨组(75 mg/kg)使血小板降低。说明ELB在体内能抑制肿瘤生长,并且产生的毒副作用低于吉西他滨。4、ELB对小鼠体内肿瘤血管生成相关因素的研究。通过免疫荧光染色观察ELB对肿瘤的血管形成、VEGF蛋白的释放、巨噬细胞的募集作用,q-PCR方法检测肿瘤中VEGF-A mRNA的表达情况。结果显示:ELB能够显著抑制肿瘤的血管生成,同时能抑制肿瘤中巨噬细胞的募集、抑制VEGF蛋白的释放及降低VEGF-A mRNA的表达。表明ELB能够通过抑制肿瘤中血管生成来抑制肿瘤生长。本研究结果表明:ELB在体内外均能抑制乳腺癌的生长,且不影响血小板的水平,其作用机制可能是通过抑制血管生成相关因子的表达。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

第一部分：ELB 体外抗肿瘤活性的研究。首先通过 MTT 实验检测 ELB 对不同肿瘤细胞增殖的影响，发现 ELB 对 4T1 乳腺癌细胞的抑制作用最显著。进一步通过 q-PCR 方法检测 ELB 对 4T1 乳腺癌细胞血管生成相关因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表达。第二部分：ELB 体外介导巨噬细胞抗血管生成作用的研究。首先通过 MTT实验、q-PCR 和 ELISA 检测 ELB 对巨噬细胞增殖、血管生成相关因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表达及 VEGF 蛋白的影响；再通过 MTT 实验、细胞划痕实验、Matrigel 基质胶细胞成管实验，观察 ELB 通过巨噬细胞对内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。第三部分：ELB 体内抗肿瘤活性的研究。构建 4T1 荷瘤小鼠模型，分组给予不同剂量的 ELB 后，考察不同组小鼠的肿瘤体积变化、瘤重、抑瘤率及小鼠体重变化，研究 ELB 对肿瘤的抑制作用。然后通过免疫荧光染色观察 ELB 对肿瘤的血管形成、巨噬细胞募集作用、VEGF 蛋白的表达，q-PCR 方法检测肿瘤中VEGF-A mRNA 水平，血常规测血小板的含量。本课题的研究思路如图 1.1 所示。

图 2.1 ELB 作用于不同肿瘤细胞 48h 后的细胞增殖。（A）LLC 细胞。（B）4T1 细胞。（C）SMMC-7721 细胞。（D）A549 细胞。（E）H1299 细胞。2.3.2 ELB 抑制 4T1 细胞血管生成相关因子 mRNA 的表达肿瘤的生长需要血管为其提供氧气和营养物质[75]。为了探讨 ELB 对 4T1 细胞内血管生成因子 mRNA 表达的影响，将不同浓度的 ELB（5 μM、10 μM、20 μM）作用 4T1 细胞 3 h 后提取总 RNA，用 q-PCR 方法检测 4T1 细胞内血管生成相关因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表达水平。实验结果如图 2.2 所示，与 Control 组相比，ELB 以剂量依赖性抑制细胞内 VEGF-AmRNA、bFGF mRNA的表达，各组与 Control 组相比均有显著性差异，且在 20 μM 时抑制作用最显著（图 2.2 A 和图 2.2 B）；ELB 也呈剂量依赖性抑制细胞内 MMP-9 mRNA 的表达，但只有在 20 μM 时有显著性差异（图 2.2 C）。以上结果表明 ELB 能抑制4T1 细胞内 VEGF-A、bFGF、MMP-9 mRNA 的表达。A BC

不同肿瘤细胞 48h 后的细胞增殖。（A）LLC MMC-7721 细胞。（D）A549 细胞。（E）H1 4T1 细胞血管生成相关因子 mRNA 的要血管为其提供氧气和营养物质[75]。为了 mRNA 表达的影响，将不同浓度的 ELB（ 后提取总 RNA，用 q-PCR 方法检测 4T1bFGF、MMP-9）mRNA 的表达水平。实，ELB 以剂量依赖性抑制细胞内 VEGF-Aontrol 组相比均有显著性差异，且在 20 μ.2 B）；ELB 也呈剂量依赖性抑制细胞内μM 时有显著性差异（图 2.2 C）。以上-A、bFGF、MMP-9 mRNA 的表达。BC
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本文编号：2865959