海肾萤光素酶生物发光探针的设计、合成及评价

发布时间：2020-11-04 18:43

　　 生物发光(bioluminescence)是发生在生物体内的一种特殊类型的化学发光,生物发光不依赖外界的光,是体内的化学物质在酶的催化作用下将化学能转变为光能的过程。生物发光成像技术具有非侵袭性、灵敏度高、选择性好、可视化及能够实现实时动态监测等优点已被广泛应用于各个领域。生物发光检测工具逐渐被开发出来,有些已经成功的应用到实际生产之中。常见的生物发光系统主要是萤火虫萤光素酶生物发光系统、腔肠素萤光素酶生物发光系统与生物发光细菌系统。以咪唑并吡嗪酮为母核的腔肠素底物分布广泛,能够被多种萤光素酶催化发出蓝色的光,而且不需要其他辅助因子。腔肠素萤光素酶生物发光系统比较简单、底物有很好的生物相容性、背景荧光低、受干扰少,有利于研究体内生理病理过程。腔肠素萤光素酶生物发光系统中研究最多的是海肾萤光素酶生物发光系统,在氧气的条件下底物被海肾萤光素酶氧化、环化,形成四元环中间体,四元环中间体很快发生裂解,产生CO2与激发态的酰胺类衍生物,酰胺类衍生物由激发态向基态跃迁的过程中,多余的能量以光子的形式释放,发射出蓝绿色的光。在腔肠素类似物的研究基础上,我们分别设计、合成了二种小分子的生物发光探针:硝基还原酶(NTR)探针和硫化氢(H2S)探针,用于硝基还原酶与硫化氢的体内外检测。本论文主要包括:一、前言;二、海肾萤光素酶底物的合成;三、硝基还原酶探针的设计、合成以及评价;四、硫化氢探针的设计、合成以及评价。肿瘤细胞缺氧通常可导致胞内的还原酶水平升高,例如硝基还原酶(nitroreductase),在缺氧条件下,以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nico-tinamide adenine dinucleotide,NADH)作为电子供体,外源性芳香族硝基化合物在硝基还原酶的催化下发生单电子转移,生成硝基阴离子自由基,随后进一步被还原成羟胺或氨基。基于这种还原行为我们设计了硝基还原酶生物发光探针检测实体瘤的缺氧状况。以4-硝基苄基、2-硝基苄基取代腔肠素类似物的羰基,当硝基被还原成氨基后发生重排消除反应,释放出底物,被酶催化发光,从而实现检测硝基还原酶的目的。并且对探针的体外、细胞水平及动物水平的应用进行了考察。结果表明,探针A1、A2、A5的相对生物发光强度与溶液中硝基还原酶的浓度呈良好的线性关系。在其他相关性物质浓度是硝基还原酶浓度100倍以上情况下,探针A1、A2、A5相对生物发光强度是其他相关性物质3倍以上,说明我们设计的生物发光探针具有良好的选择性,在体外可实现对硝基还原酶的定性、定量检测。在细胞水平上研究结果显示探针A5表现出了良好的生物相容性,能够用于检测细胞内源性硝基还原酶水平。并且A5可以用来检测肿瘤区域的硝基还原酶水平,肿瘤区域生物发光强度与对照组相比增加了7倍。因此,我们设计的硝基还原酶探针能够用于检测肿瘤缺氧环境。硫化氢是调节血管、神经、免疫系统重要的信号分子,细胞一旦无法维持正常的硫化氢浓度,就会出现各种疾病。为了更好的了解硫化氢在机体内的产生、转运、代谢过程,我们开发了一种新型硫化氢检测方法。4-叠氮基苄基取代腔肠素类似物羰基后,底物不能被酶催化发光,当叠氮基被硫化氢还原生成氨基后发生重排消除反应,释放出底物,被酶催化发光,基于此我们设计了两个硫化氢探针。在分子水平上探针表现出优良的选择性、灵敏度,相同条件下,硫化氢探针相对生物发光强度是其他相关性物质的3倍以上。而且探针可以用于检测细胞中的硫化氢水平。在动物体内上,探针C1硫氢化钠组生物发光强度是生理盐水组的4倍。因此,我们设计的基于海肾萤光素酶硫化氢探针能够用于体内硫化氢的检测。我们以海肾萤光素酶生物发光体系为基础设计合成硝基还原酶和硫化氢探针,可以成功的用于细胞和生物体内硝基还原酶和硫化氢的检测,为研究与硫化氢相关的生理病理过程提供了一种新方法。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R91
【部分图文】：

１．２．２腔肠素生物发光体系??以咪唑并吡嗪酮为底物的生物发光系统可以分为发光蛋白和莖光素酶类型??（图１－２）。［２］由莖光素酶催化的生物发光反应是典型的酶促反应，其中底物被??〇２氧化产生处于激发态的产物（氧化莖光素），然后激发态向基态跃迁的过程中??发射出光。底物被萤光素酶完全催化。在发光蛋白类型的生物发光体系中，蛋白??质形成稳定的酶－底物复合物需很长时间。研究得最多的是一种Ｃａ２＋调控的载脂??蛋白。［７３］载脂蛋白与腔肠素非共价结合形成发光蛋白，然后在氧气分子的作用??下形成氧化腔肠素。钙离子与蛋白质分子表面上的钙离子结合位点结合启动生物??发光。Ｃａ２＋的结合引起蛋白质底物结合空腔中的构象变化，使蛋白与２－羟基过氧??化腔肠素氢键断开，引发氧化脱羧反应，形成激发态的产物。［９］由于发光所必需??的底物已经与发光蛋白结合，这不同于萤光素酶发光系统，因此只能反应一次不??能反复几次。反应中涉及一个分子

萤光素酶是一种单体蛋白质，其在氧气的存在下催化腔肠素脱羧，形成腔肠酰胺，??释放出二氧化碳和发射出蓝光。［１１４４］海肾萤光素酶－腔肠素体系生物发光机制如??图１－３所示：（１）首先０２与咪唑并吡嗪酮母核Ｃ－２位结合，生成过氧化物；（２）??过氧化物中间体迅速形成四元环中间体；（３）不稳定的四元环中间体裂解释放出??二氧化碳，同时生成激发态的酰胺类化合物；（４）酰胺类化合物由激发态向基态??跃迁的过程中，发射出蓝绿色的光；（５）最终形成腔肠酰胺。??ｆ?ｎｈ?＾??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ?ｎ＾ｎ??Ｈ〇?＂?０?Ｈ〇ｉｊ?＂＂Ｉ?Ｐｅｒｏｘｉｄｅ??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ?ｋＪ＊??丨—？?１。－??０Ｙ＾－Ｏ＿０Ｈ?Ｒｅｎｉｌｌａ?Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?〇??『ｎＹＮＳ?（３６?ｋＤａ）?ｒＮ?Ｎ８??．?ｏ＾－ｈ０＞－ｏｈ?ｊ?Ｄｉｏｘｅｔａｎｏｎｅ??ｉＹ９?－ｉ??．Ｊ?ｃ〇２??Ｓｉｎｇｌｅｔ?ｅｘｃｉｔｅｄ－ｓｔａｔｅ?ａｍｉｄｅ?ａｎｉｏｎ??图１－３海肾萤光素酶－腔肠素体系发光机制??９??

Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ?Ｃａ２＋－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ?ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ??图１－２萤光素酶和发光蛋白类型的生物发光系统［２］??海肾萤光素酶生物发光系统各种腔肠素生物发光系统中研宄比较多的。海肾??萤光素酶是一种单体蛋白质，其在氧气的存在下催化腔肠素脱羧，形成腔肠酰胺，??释放出二氧化碳和发射出蓝光。［１１４４］海肾萤光素酶－腔肠素体系生物发光机制如??图１－３所示：（１）首先０２与咪唑并吡嗪酮母核Ｃ－２位结合，生成过氧化物；（２）??过氧化物中间体迅速形成四元环中间体；（３）不稳定的四元环中间体裂解释放出??二氧化碳，同时生成激发态的酰胺类化合物；（４）酰胺类化合物由激发态向基态??跃迁的过程中，发射出蓝绿色的光；（５）最终形成腔肠酰胺。??ｆ?ｎｈ?＾??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ?ｎ＾ｎ??Ｈ〇?＂?０?Ｈ〇ｉｊ?＂＂Ｉ?Ｐｅｒｏｘｉｄｅ??Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ?ｋＪ＊??丨—？?１。－??０Ｙ＾－Ｏ＿０Ｈ?Ｒｅｎｉｌｌａ?Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?〇??『ｎＹＮＳ?（３６?ｋＤａ）?ｒＮ?Ｎ８??．?ｏ＾－ｈ０＞－ｏｈ?ｊ?Ｄｉｏｘｅｔａｎｏｎｅ??ｉＹ９?－ｉ??．Ｊ?ｃ〇２??Ｓｉｎｇｌｅｔ?ｅｘｃｉｔｅｄ－ｓｔａｔｅ?ａｍｉｄｅ?ａｎｉｏｎ??图１－３海肾萤光素酶－腔肠素体系发光机制??９??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 祝静静;鲍秋颖;王宇萌;夏钢;;建立利用萤光素酶快速检测细胞活性的方法[J];华东师范大学学报(自然科学版);2012年05期

2 付昕阳;王刚;田文洪;陈素云;董小岩;吴小兵;谭万龙;;双萤光素酶共表达载体构建及特性研究[J];病毒学报;2010年04期

3 孙万儒;值得重视的新型酶试剂—萤光素酶[J];生物工程进展;1990年03期

4 陈贵;胡文玉;;LKB——1250型发光光度计法测定植物组织ATP含量[J];沈阳农业大学学报;1987年S1期

5 孙国凤;;源氏萤虫萤光素酶基因的克隆化[J];生物技术通报;1988年08期

6 朱群,白永延,毛慧珠,罗士韦;甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达[J];植物生理学报;1989年01期

7 孙国凤;;日销售美制利用虫萤光素酶的微生物检测装置[J];生物技术通报;1989年01期

8 王金发;许友卿;李宝健;;萤火虫萤光素酶基因转化花叶芋及表达的研究[J];中山大学学报论丛;1989年04期

9 王维光;;虫萤光素酶系的制备及性质[J];植物生理学通讯;1982年04期

10 单志新;林秋雄;谭虹虹;邓春玉;刘晓颖;肖定璋;余细勇;;利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA[J];南方医科大学学报;2009年08期

相关博士学位论文 前10条

1 王林涛;1. p38对COX-2转录后调控的作用与胰岛β细胞功能关系的研究 2. 萤光素酶报告基因分析转录后调控元件方法研究[D];南京医科大学;2008年

2 温冬青;US28调节MIE基因介导的人巨细胞病毒活化的通路研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年

3 李晖;APOBEC3G转录调控机制研究[D];南方医科大学;2009年

4 赵永娟;Nur77转录调控靶基因的鉴定及其生理功能的初步研究[D];中国协和医科大学;2007年

5 杨桂花;红系分化相关miRNA的鉴别与功能研究[D];中国协和医科大学;2008年

6 金蕊;人ORMDL3基因的转录调控研究[D];南京医科大学;2012年

7 胡赟;miR-29c通过胰岛素样生长因子1抑制人血管内皮细胞迁移和血管生成的研究[D];重庆医科大学;2015年

8 王海林;阿尔茨海默病中microRNA-106b作用机制的研究[D];北京协和医学院;2010年

9 曹丽华;不同肢端畸形中基因突变鉴定及致病机制研究[D];中国医科大学;2009年

10 李广平;藏族原发性高血压的遗传学基础[D];北京协和医学院;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 杨兴业;海肾萤光素酶生物发光探针的设计、合成及评价[D];山东大学;2018年

2 袁明亮;海肾萤光素酶生物发光底物及探针的设计、合成和活性研究[D];山东大学;2017年

3 孙鹏宇;不同前列腺癌细胞高效启动子筛选和双萤光素酶慢病毒载体的构建[D];南方医科大学;2011年

4 张华腾;基于萤火虫生物发光原理的成像探针及抑制剂的研究[D];山东大学;2016年

5 于雅丽;食管癌组织中DAN聚合酶β启动子突变的初步研究[D];郑州大学;2008年

6 卫艳萍;建立作用于CCR5启动子的药物筛选方法及初步应用[D];郑州大学;2008年

7 郑霞;CHRNA5基因启动子区多态与肺癌的遗传易感性分析及功能研究[D];复旦大学;2010年

8 胡辛楠;2，2'，4，4'-四溴联苯醚（BDE-47）诱导孕烷X受体（PXR）致甲状腺毒作用机制的初步探讨[D];广州医学院;2010年

9 李苗;GATA-1乙酰化对WNK4基因表达调控机制的研究[D];中国医科大学;2008年

10 张浩明;HepG2与HepG2.2.15细胞miRNA差异表达谱分析及部分miRNA功能的初步研究[D];苏州大学;2008年

本文编号：2870460