一种肿瘤酸度响应Beclin 1功能蛋白的表达及生物活性评价

发布时间：2020-11-05 06:22

　　 Beclin 1可以诱导自噬发生,在肿瘤生长过程中发挥重要作用。据报道:在75%的卵巢癌、40%的前列腺癌和50%的乳腺癌中存在Beclin 1基因的缺失性突变,导致自噬功能降低。因此,若能提高这些肿瘤中Beclin 1的含量,肿瘤细胞就会因过度自噬而死亡,从而达到抑制肿瘤生长的目的。然而,Beclin 1自身不能进入细胞,缺乏组织特异性而且体内稳定性差,限制了其在肿瘤治疗方面的应用。本课题根据肿瘤酸性微环境和低pH插入肽(pHLIP)在酸性条件下可高效穿过细胞膜的特性,首次设计并原核表达了Trx-pHLIP-Beclin 1(TpB)融合蛋白,并在细胞和动物水平对其抗肿瘤活性进行了验证。本论文主要有以下三部分研究内容:(1)化学合成pHLIP-Beclin 1基因将其连接到pET-32a表达载体上,转化到E.coli BL21(DE3)表达宿主,通过Ni离子亲和层析柱纯化获得目的蛋白TpB。通过SDS-PAGE、质谱(MALDI-TOF-MS)及圆二色谱对纯化后的蛋白进行表征。蛋白纯度可达95%以上、氨基酸序列正确。在弱酸性(pH 6.5)条件下与POPC脂质体孵育后,TpB可在193 nm处出现一正峰,在209 nm和222 nm处出现两个负峰。以上结果表明TpB成功表达,其在弱酸性条件下可形成跨膜α螺旋。(2)选用人乳腺癌细胞系MCF-7和人卵巢癌细胞系SKOV3作为研究对象,通过MTT、结晶紫染色和CFDA-SE方法检测TpB对肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用。MTT结果表明:在pH 6.5条件下,TpB对两种细胞的IC_(50)值分别为12.79?M和16.73?M。10?M TpB处理两种细胞后,细胞内CFDA-SE荧光强度显著增加,表明TpB显著抑制了两种细胞的增殖。为了验证TpB细胞毒性的分子机制是否是自噬性细胞死亡,我们通过AO染色法、Ad-mCherry-GFP-LC3B慢病毒转染、TEM和Western blot等方法检测了TpB的自噬诱导活性。结果表明在pH 6.5条件下,10?M TpB可诱导两种细胞发生大量自噬。因此,TpB对两种细胞的毒性可归结于其自噬诱导活性。(3)通过皮下注射SKOV 3细胞建立荷瘤裸鼠模型,将荷瘤裸鼠分为四组:生理盐水、Trx、Beclin 1和TpB组,每两天尾静脉注射给药一次,测量肿瘤体积。结果表明,TpB明显抑制了肿瘤的快速生长,而Trx和Beclin 1处理组对肿瘤生长没有抑制作用。为了揭示TpB抑制肿瘤生长的分子机制,对各处理组的肿瘤组织进行了HE染色、免疫组织化学染色和Western blot分析。TpB处理组细胞数量明显减少并且细胞形态发生了显著变化,细胞增殖标志物Ki-67表达下调,而自噬标志物LC3水平升高、p62水平降低,表明TpB通过激活自噬过程来抑制肿瘤生长。为了检测TpB的体内生物分布并评价其肿瘤靶向性,我们分离了对照组和各处理组的肿瘤组织和正常组织(心、肝、脾、肺、肾),进行Western blot分析和免疫组织化学染色。结果显示:TpB可选择性地进入肿瘤组织并在肿瘤中累积,而不会进入各正常组织。为验证TpB的生物安全性,我们记录了裸鼠体重变化,并对各正常组织进行HE染色,结果表明各组裸鼠体重变化很小(在19-21 g之间波动),各组小鼠主要器官均未见明显的形态学变化,说明TpB不会对这些正常器官造成损伤。综上,我们首次设计并成功原核表达Beclin 1功能蛋白Trx-pHLIP-Beclin 1(TpB),在细胞和动物水平均证实其可以在弱酸性条件下将Beclin 1保守序列靶向递送至肿瘤细胞或组织,通过诱导自噬来抑制肿瘤生长,并对正常器官没有毒副作用。本研究可为进一步设计和开发新型肿瘤酸度响应策略提供新思路。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914;R96
【部分图文】：

1.1.1 细胞自噬概述自噬在大多数细胞中以基本相同的速率发生，它是一种重要的、保守的溶酶体降解过程[1]，可清除功能紊乱细胞器或受损大分子，通过限制活性氧（ROS）产生和线粒体内有毒蛋白质释放对细胞产生保护作用[2]。而异常自噬会引发很多疾病，如神经退行性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、心脏病、传染病、炎症和癌症等，这些疾病的发生与异常自噬密切相关[3-7]。1.1.2 细胞自噬过程细胞自噬过程如图 1.1 所示，由双膜结构的自噬小体形成所引发的，自噬体在细胞质中多个位置随机形成，它将细胞质物质固定在一个不降解的室里。自噬小体沿着微管向微管组织中心输送，使它们接近溶酶体，随后小泡与溶酶体融合，将受损细胞器、错误折叠的蛋白质以及病原体进行降解。细胞内被降解物质通过膜上的通透酶输送到胞浆中得以重新利用[8]，在细胞外部营养物质供应有限的情况下也可以作为代谢的替代能源，以维持细胞新陈代谢平衡增强生存能力。

Beclin 1 由 Beclin 1-Atg 14、Vps 34、p 150 和 NR成的起始和成熟过程中起着关键作用[24]。uces autophagy. Beclin 1-Vps34 complex I is comp0 and NRBF2. This type of class III PI3K complex of autophagosome formation[24].发生于人类染色体 17q21 上的一个肿瘤易感位高达 75 %）和前列腺癌（约 40 %）中自噬缺失[26,27]。在人乳腺癌细胞系和肿瘤组织中正常乳腺上皮中 Beclin 1 普遍高表达。因此以抑制肿瘤的发生，并在人乳腺癌中的表eclin 1 的表达减少可能有助于乳腺癌和其他 Beclin 1 则可增强乳腺癌细胞的死亡，抑制瘤治疗研究者已经将 Beclin 1 用于肿瘤治疗。Li

1.3 正常细胞与肿瘤细胞呼吸作用对比图。(a)大多数正常细胞进行有氧呼吸，葡萄糖产生的酮酸被吸收到三羧酸循环(线粒体)中。(b)肿瘤细胞中葡萄糖转化为乳酸[34]。igure 1.3 The respiratory profile. (a) Most normal cells engage in aerobicrespiration, whereyruvate generated from glucose is recruited into the Krebs cycle (mitochondria). (b) Glucoseonverted to lactic acid in cancer cells[34].1.3.2 pHLIP低 pH 插入肽（pH low insertion peptide, pHLIP）是来源于细菌视紫红质 C 螺的一种水溶性多肽，由 AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT 36 氨基酸组成[38 40]。pHLIP 有三种存在状态，如图 1.4 所示：第一种是以无结构的状溶解于水溶液中（State I）；第二种是作为一种无结构的多肽与细胞膜表面松散结（State II）；第三种是在酸性条件下，通过形成稳定的跨膜α螺旋将其 C 端插入细膜中（State III）[41]。因此，在酸性环境下 pHLIP 可通过形成稳定的跨膜α-螺旋将接在其 C 端不能进入细胞的物质递送至细胞内[42]。
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本文编号：2871252