两株泥蜂共生链霉菌次级代谢产物及其生物活性研究

发布时间：2020-11-07 19:06

　　 链霉菌产生的次级代谢产物结构丰富,活性广泛,常具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等生物活性,是微生物药物的重要来源。人们从土壤链霉菌中发现新颖结构及活性物质的几率越来越小,昆虫共生微生物一般存在于昆虫肠道、外骨骼、特殊器官或者细胞中,这种特殊的生境为结构独特、活性多样的代谢产物的产生提供了可能。因此,对昆虫链霉菌化学成分的研究可以为研发新药提供潜在的先导化合物,具有一定的研究价值。黄柄壁泥蜂膜翅目、泥蜂科昆虫,多独栖、捕食蜘蛛与其它昆虫幼虫。采用稀释涂布平板法从黄柄壁泥蜂幼蜂体内外共分离得到22株放线菌。经16S rDNA的序列分析,结果表明大多数菌株属于链霉菌属。采用滤纸片法和平板对峙法抗菌活性检测,发现2株对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果,其他的菌株活性很弱或者无活性。本论文对两株具有较强抗菌活性的链霉菌菌株1512-3和1510-2的次级代谢产物进行了初步研究。链霉菌1512-3基因组测序,通过antiSMASH软件分析,发现其含有23个次级代谢产物生物合成基因簇,并对基因簇合成的次级代谢产物进行了预测,包括萘啶霉素、浅内红霉素、拒霉素等,采用柱色谱等分离技术从发酵液中分离得到4个化合物,采用HR-ESI-MS及NMR等波谱数据分析鉴定其结构为resistomycin(拒霉素)、genistein(染料木素)、daidzein(大豆甙元)和 pyrrole-2-carboxylic acid。Resistomycin对铜绿假单胞,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都没有活性,pyrrole-2-carboxylicacid对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞都有良好的抗菌活性,其抑菌圈分别为9 mm、10.5 mm、11mm。采用MTT法对细胞细胞毒性进行检测。Resistomycin 对 MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231 这三株人乳腺癌细胞的增殖都具有较好的抑制作用,IC50分别为1.32 μM、2.47 μM、0.64μM。链霉菌1510-2基因组测序,通过antiSMASH分析,发现含有32个次级代谢产物的生物合成基因簇,并对基因簇合成的次级代谢产物进行了预测,包括抗霉素A、噻可拉林和放线菌素等。采用柱色谱等分离技术从发酵液中分离得到7个化合物,HR-ESI-MS及NMR、X-RAY等数据分析鉴定其结构为三个新的三联苯化合物SGr-02、SGr-06、SGr-07、放线菌素V、放线菌素D及两个酸性化合物pyrrole-2-carboxylic acid、(E)-3-甲硫基丙烯酸。采用滤纸片法活性检测,放线菌素V对革兰氏阳性菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌效果,抑菌圈分别为42 mm、30 mm、38 mm;其MIC分别为0.976 μg/mL、3.906 μg/mL、1.953 μg/mL。而对大肠杆菌没有活性,放线菌V还对多种致病真菌都有活性。又对SGr-02、SGr-06、SGr-07这三个测试了已糖激酶Ⅱ活和人肝癌细胞系(HEPG-2、SMMC-7721、PLC-PRF-5)活性,发现这三个化合物对已糖激酶Ⅱ和人肝癌细胞都有抑制作用。化合物SGr-02对已糖激酶Ⅱ和PLC-PRF-5肝癌细胞抑制作用活性最强(IC50分别为7.959 μM、1.944 μM)。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R915
【部分图文】：

这些产物是基因簇所编码的，这些基因簇一旦能够在菌体细胞中表达，那么??该基因所表达的产物就可以通过摇瓶大批量的发酵生产萃取粗提物，并利用ＨＰＬＣ－ＭＳ??分析，完成对物质的结构进一步鉴定（图１）［１９］?＿??ｐｒｅｄｉｃｔ８〇ｎ?＞??ｘ?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ??人??图１生物信息学辅助分析过程来自参考文献１９??在确定基因序列后，用生物信息学分析基因组序列进行功能挖掘，尽可能地预测酶的??结构。生物信息学软件主要包括?ＢＬＡＳＴ［３１＿３２丨?ＧｅｎｏｍｅＴｈｒｅａｄｅｒ［３３＿３４］，?ＨＭＭＥＲ［３＇?ＮＯＲ??ＩＮＥ［３６］，ＳＢＳＰＫＳ［３＇?ａｎｔｉＳＭＡＳＨ［３８］，ＮＲＰＳｓｐ［３９］，ＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２［４０］，ＰＫＳ／ＮＲＰＳ?Ａｎａｌｙｓ??ｉｓ［４１］，这些数据库和分析软件在基因组挖掘的过程中有着很重要的作用，比如对发现生??３??

息分析的前体）加入培养基中，从而能够识别天然产物。通过同位素标记技术发现荧假单胞菌通过生物代谢产生具有生物活性的ｏｒｆａｍｉｄｅｓ?Ａ－Ｃ化合物，利用生物信息学件预测出ｏｒｆａｍｉｄｅ?Ａ的结构，然后在发酵液中添加用同位素标记好的亮氨酸，最终测发现目标产物，是从ＰＦ－５的培养中分离出来的，称为ｏｒｆａｍｉｄｅＡ，它被证明在产细菌的活动中起作用，并显示出抗菌活性［４４］。如下图２??

ｎ．图３异源表达的方法??基因敲除技术方法很直观的分析预测基因功能，避免了生物信息学预测结果的不定性，利用基因敲除技术把生物体特定功能的本来就有的基因失活缺失，表达产物无产生，与野生型相比，利用色谱法分析无法检测基因敲除突变体的目标产物，从而对
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本文编号：2874358