葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用研究

发布时间：2020-11-11 20:58

　　 目的研究葛根素对顺铂诱导小鼠耳毒性的防护作用及其机制,为临床防治顺铂所致耳聋提供新思路。方法1、在体实验100只成年BALB/c小鼠随机分为四组:对照组、顺铂组、顺铂+葛根素组和葛根素组(n=25只)。顺铂组腹腔注射顺铂4.5mg/kg/d,连续5d;葛根素组腹腔注射葛根素200mg/kg/d,连续14d;顺铂+葛根素组先提前腹腔注射葛根素200mg/kg/d,连续9d,在第10d同时腹腔注射顺铂4.5mg/kg/d,连续5d;对照组则腹腔注射等量生理盐水。应用听脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试和耳蜗毛细胞计数,观察小鼠用药前后的听力变化和毛细胞损伤情况;应用免疫荧光染色、蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)等技术检测耳蜗内基质交感分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)、Orai1、瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1)、钙蛋白酶2(calpain2)的表达。2、离体实验取新生3d BALB/c小鼠耳蜗基底膜,于无血清的新鲜培养基中常规培养24h后,弃去原培养基。将基底膜随机分为4组,对照组给予新鲜无血清培养基2ml;顺铂组给予含有顺铂(16μg/ml)的新鲜无血清培养基2ml;顺铂+葛根素组提前给予10~(-6)M葛根素无血清新鲜培养基培养30min后,加入顺铂(16μg/ml)至2ml;葛根素组给予10~(-6)M葛根素无血清新鲜培养基2ml;各组在同等条件下继续培养24h。利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽荧光染色方法,观察耳蜗毛细胞形态变化,并统计各组毛细胞数量。应用Western blot技术检测耳蜗毛细胞内STIM1和Orai1蛋白的表达;采用Ca~(2+)荧光探针Fluo-4 AM负载入毛细胞,激光共聚焦显微镜来观察各组耳蜗毛细胞内游离Ca~(2+)水平。结果1.连续给药后,顺铂组ABR阈移与对照组相比明显增大(P0.01);顺铂+葛根素组ABR阈移与顺铂组相比明显减小(P0.01);葛根素组ABR阈移与对照组相比无显著性差异(P0.05)。2.在体小鼠耳蜗和离体培养基底膜的毛细胞计数结果均显示,顺铂组外毛细胞缺失率与对照组相比显著增大(P0.01);与顺铂组相比,在体实验中顺铂+葛根素组耳蜗基底膜的底回和中回的外毛细胞缺失率明显减少(P0.01);离体实验中顺铂+葛根素组与顺铂组相比,外毛细胞和内毛细胞缺失均显著减少(P0.01);对照组与葛根素组相比,差异不显著(P0.05)。3.细胞内Ca~(2+)水平检测结果显示,顺铂组耳蜗毛细胞内的Ca~(2+)水平明显高于对照组(P0.01);而顺铂+葛根素组耳蜗毛细胞内Ca~(2+)水平与顺铂组相比显著减弱(P0.01);对照组与葛根素组相比荧光强度无明显差异(P0.05)。4.Real-time PCR结果显示,顺铂组STIM1和Orai1的mRNA水平明显高于对照组(P0.01);而顺铂+葛根素组STIM1和Orai1的mRNA水平与顺铂组相比明显降低(P0.05,P0.01);葛根素组的STIM1和Orai1的mRNA表达与对照组相比无明显变化(P0.05)。5.免疫荧光铺片结果表明,顺铂组STIM1、Orai1的阳性反应与对照组相比显著增强(P0.01);顺铂+葛根素组STIM1、Orai1的阳性反应与顺铂组相比明显减弱(P0.01);对照组与葛根素组相比无显著性差异(P0.05)。6.在体与离体实验的Western blot检测结果均表明,顺铂组的STIM1、Orai1表达与对照组相比均明显增强(P0.01);顺铂+葛根素组的蛋白表达与顺铂组相比明显减弱(P0.05);葛根素组与对照组相比蛋白表达并无明显变化(P0.05)。7.免疫荧光检测结果显示,顺铂组TRPV1和calpain2蛋白阳性表达明显强于对照组(P0.01);顺铂+葛根素组与顺铂组相比阳性表达明显减弱(P0.01);而对照组与葛根素组的荧光强度相比无明显变化(P0.05)。结论葛根素可通过减少STIM1、Orai1、TRPV1和calpain2蛋白表达,抑制耳蜗细胞发生钙超载,从而有效防护顺铂所致小鼠听功能受损。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R979.1;R764.43
【部分图文】：

组别外毛细胞缺失率（%）底回 中回 顶回对照组 3.00±1.10 3.30±1.00 2.40±2.80顺铂组 75.70±3.70**40.30±5.90**19.50±3.00*顺铂+葛根素组 36.20±4.20**△△24.00±5.10**△△16.40±2.80*葛根素组 4.30±1.00 4.00±2.70 3.10±1.80注：**与对照组比较，P＜0.01；△△与顺铂组比较，P＜0.01（三）离体耳蜗毛细胞计数结果显示，顺铂组耳蜗毛细胞出现明显的倒伏和缺失，且损伤数量明显多照组（P＜0.01）；顺铂+葛根素组与对照组相比毛细胞仍有缺失（P01），但与顺铂组相比毛细胞损伤数量减少（P＜0.01）；对照组与葛根素较无明显差异（P＞0.05）（图 1-1，图 1-2）。

注：**与对照组比较，P＜0.01；△△与顺铂组比较，P＜0.01素对顺铂致毒离体耳蜗毛细胞内 Ca2+水平的影示，TRITC-鬼笔环肽标记的毛细胞纤毛呈红色荧光，Flu Ca2+显示为绿色荧光。顺铂组毛细胞内的 Ca2+水平与对＜0.01）；顺铂+葛根素组毛细胞的 Ca2+水平与对照组相比与顺铂组相比明显降低（P＜0.01）；对照组毛细胞的 C无明显变化（P＞0.05）（图 2-1，图 2-2）。

离体耳蜗毛细胞内Ca2+水平变化
【参考文献】

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1 邸阳;于利;田原;林宇涵;王爱梅;;熊果酸对顺铂致毒小鼠耳蜗瞬时感受器电位香草酸受体1表达的影响[J];听力学及言语疾病杂志;2015年01期

2 李冰慧;;葛根素联合利多卡因治疗突发性耳聋49例(53耳)疗效观察[J];临床合理用药杂志;2014年22期

3 刘卫红;姚琦;王陈荣;王瑛;陈望燕;;葛根素注射液耳后注射联合声频共振治疗老年性聋疗效观察[J];新中医;2013年03期

4 黄绵庆;杨照新;姚茂忠;田树红;符健;;葛根素对中波紫外线损伤HaCaT细胞的抗氧化作用[J];重庆医学;2012年19期

5 许焱;史振伟;;葛根素致急性肾衰竭1例与发病机制探讨[J];医药导报;2012年04期

6 陈鑫;邱建华;;葛根素对噪声性聋的防治作用[J];听力学及言语疾病杂志;2011年04期

7 刘斌;任基浩;葛益林;;葛根素对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤时听功能和IκBα的影响[J];中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志;2009年05期

8 董杨;王静;施建蓉;韩志芬;郭瑞新;;葛根素对庆大霉素所致小鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗效应[J];中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志;2008年06期

9 郭密;韦倩;张仲君;徐寿水;姜萍;;中药葛根素抗缺氧及抗氧化的药效学研究[J];解放军保健医学杂志;2007年02期

10 闻国华;钱茂华;赵松;陈平;管沛;马莉;徐霞;黄志俊;汪晓雷;;丹参注射液预防顺铂耳毒性的临床研究[J];交通医学;2006年06期

本文编号：2879732