黄斑水肿(Macular edema,ME)作为视网膜疾病中心视力损害的主要原因,是临床迫切需要治疗的眼病之一。然而,目前黄斑水肿的治疗主要依赖于格栅样激光光凝、玻璃体腔内注药、球后/球周注射等有创治疗手段,这些治疗不但伴随有术后盲点、玻璃体腔出血、眼内炎等多种并发症的发生,而且患者依从性较低。因此,寻求一种安全、有效的黄斑水肿的治疗方案,是目前眼科领域亟待解决的问题之一。点眼具有简单易行、易于存储、副作用少等优点,是一种理想的、可选择的给药途径。但传统滴眼液生物利用度低,点眼后因泪液冲刷和鼻泪管外排等多种清除机制及眼部屏障的存在,只有1-10%或者更少的药物到达眼前节,无法或更少一部分药物到达眼后节。近年来,纳米递药系统如脂质体、纳米粒、纳米乳等在眼科领域的应用引起了广泛的关注,并成为促进药物向眼后节有效递送的希望。以往研究证实,脂质体(liposome)因具有角膜穿透性好、生物相容性强、无毒、缓释、半衰期长等优点,更适宜于眼科领域的应用。然而,普通脂质体由于存在包封率低、生物利用度低等问题很难将有效药物浓度递送至眼后节。因此,探索并设计一种新的眼部递药系统,能将药物有效递送至眼后节,并克服普通脂质体低包封率、低生物利用度的问题,是目前该领域的热点和难点之一。醋酸钙梯度法(calcium acetate gradient)通过形成膜内外离子梯度,可大大提高药物包封率,因此,本实验尝试采用醋酸钙梯度法制备脂质体以求克服普通脂质体低包封率的问题。壳聚糖(chitosan,CH)作为一种具有阳离子特性的天然生物材料,对眼表吸附性强、滞留时间长,故而可增加药物与眼表作用以提高生物利用度。因此,本实验选择壳聚糖作为表面修饰,以增加眼表粘附性及角膜渗透性,从而克服普通脂质体生物利用度低的问题。曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)TA具有抗炎、抗新生血管生成、抗凋亡和神经保护等特性,同时还可以减轻细胞的免疫反应、稳定血房水及血视网膜屏障、阻止成纤维细胞的化生、抑制上皮细胞的增生等。但由于曲安奈德为脂溶性药物,溶解度低,大大限制了其在眼科的应用。本研究旨在建立并评估一种新型、高效的曲安奈德纳米递药系统,通过点眼的方式,将药物递送至眼后节并发挥作用。因此,本课题以曲安奈德为模型药物,以脂质体为载体,壳聚糖为表面修饰,成功制备出曲安奈德壳聚糖脂质体(triamcinolone acetonide chitosan-coated liposomes,TA-CHL)滴眼液。通过电镜观察、粒径分布、表面电位测定、包封率测定、差示扫描量热法、体外释放、稳定性等对TA-CHL的理化性质进行了初步考察;利用光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography system,OCT)、人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCEC)和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,ARPE-19)细胞摄取实验以及通过建立糖尿病性视网膜水肿大鼠模型,从药效学角度对其进行了进一步探究;通过监测眼压变化、苏木精-伊红染色法(hematoxylin eosin staining,HE)和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术法(TdT-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL)对脂质体点眼后大鼠的眼部安全性进行了初步评价。本研究以脂质体包封率为主要评价指标,考察不同制备工艺对曲安奈德壳聚糖脂质体包封率的影响,重点对制备方法、有机溶剂种类的选择、孵化温度、孵化时间、探头超声时间、探头超声功率、旋蒸时间、水合温度、醋酸钙浓度、胆固醇:卵磷脂之比、药脂比等因素进行了考察,采用正交设计筛选出最优处方和制备工艺,具体为:采用醋酸钙梯度法,醋酸钙浓度120 mmol/1,药脂比为1:15,胆固醇:卵磷脂为1:8,孵化温度为37 ℃,孵化时间60 min,探头超声功率为90 w,探头超声时间5 min,旋蒸时间为30 min,水合温度50℃。由上述优化条件下制备所得TA-CHL制剂为白色略带乳光的胶体溶液,电镜下呈大小均匀、表面被覆一层欠光滑包膜的圆形囊性颗粒,其分散好,无粘连和聚集;粒径为135.46 ± 4.49 nm,Zeta电位为17.98 ± 3.21 mv,包封率为90.66 ± 3.21%;差示扫描量热法结果提示TA-CHL中曲安奈德在328.27℃的吸收峰消失,表明TA被成功包裹进了 TA-CHL中,不再以晶体结构形式存在;体外释放实验提示TA-CHL中TA的释放持久、缓慢,约70%TA从TA-CHL释放需24 h,具有显著缓释作用;稳定性实验结果表明TA-CHL在冷藏4℃保存30 d和60 d均稳定好。为从药效学角度评价CHL作为药物载体对眼前后节的递送效率,特制备荧光香豆素6脂质体(Coumarin-6 liposomes,C6-liposomes)和香豆素6壳聚糖脂质体(Coumarin-6 chitosan-coated liposomes,C6-CHL),OCT动态观察给予BN大鼠点眼后不同时间点眼前、后节药物的分布情况,比较不同时间点药物分布的相对荧光密度(relative intensity of fluorescence)。结果显示,CHL、liposomes两种载体均可将药物递送至眼后节,但相比而言,CHL的递送效能要优于普通liposomes的递送效能,其生物利用度更高。通过HCEC和ARPE-19细胞摄取实验,利用荧光显微镜分别观察细胞孵育5 min、10 min、15 min、30 min、240 min后,HCEC及ARPE-19细胞对C6-CHL、C6-liposomes的摄取情况,结果显示,在以上不同时间点C6-liposomes和C6-CHL均能够被HCEC和ARPE-19细胞摄取,且两种细胞对C6-CHL的摄取能力优于对C6-liposomes的摄取。此外,本课题通过建立糖尿病性视网膜水肿大鼠模型,给予大鼠TA-CHL和TA-liposome滴眼液点眼后,HE染色和电镜观察,结果表明,两组大鼠视网膜水肿情况较前减轻,且TA-CHL对视网膜水肿的改善程度要优于TA-liposomes对视网膜水肿的改善程度;而普通曲安奈德溶液点眼后视网膜水肿程度无改善。因此,以上结果均表明,CHL能成功将曲安奈德有效递送至眼后节并发挥作用,是一种比普通脂质体生物利用度更高的眼部递药系统。通过监测眼压变化、HE染色及TUNEL检测对TA-CHL滴眼液点眼后眼部安全性进行了考察。结果表明,给予大鼠TA-CHL滴眼液点眼后15天、30天、90天后眼压与点眼前相比,眼压变化无统计学意义;HE染色结果示TA-CHL点眼后结膜、角膜组织均无明显水肿、坏死及炎性细胞浸润;TUNEL检测结果示TA-CHL点眼后均无明显TUNEL阳性细胞的增多,视网膜细胞凋亡小体数量没有增加。以上结果表明,TA-CHL滴眼液点眼后无眼压升高、无眼部刺激性及毒副作用的发生,是一种安全性好的新型滴眼剂型。本课题设计并证实了新型眼药水制剂TA-CHL滴眼液能有效将曲安奈德递送至眼后节并发挥其作用,克服了普通脂质体低包封率、低生物利用度的问题,是一种新型、高效、安全的用于治疗视网膜水肿的眼药水制剂。因此,本课题的研究为曲安奈德的临床应用提供了一种有效、安全的新剂型,为不同原因所致黄斑水肿的治疗提供了新途径和新方向。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943;R96
【部分图文】：
１．１?ＴＡ检测波长及含量测定方法的建立??１．１．１检测波长的确定??由所得紫外吸收图谱图１－１和图１－２可见，ＴＡ在２４０?ｎｍ处有峰值吸收，??而空白辅料在峰值２４０?ｎｍ处略有吸收。因此推知，若选用紫外分光光度计对??ＴＡ进行含量的测定，空白辅料在峰值处的吸收，必将对ＴＡ含量的测定会造成??一定的干扰。显然，本实验选用紫光分光光度计测量ＴＡ的含量是不可行的。??因此，本实验特选择高效液相色谱法（ｈｉｇｈ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，??ＨＰＬＣ）对曲安奈德进行含量的测定。??：．．．．．Ｉ．．．．．．｜．．．．．．｜．．．．．．Ｉ．．．．．．：．．．．．．：—；—：．．．．．．?－??＿?／ｉｌ?ｉ?丨?ｉ?Ｖｔｉｌ－１．．．．．．！．．．．．．ｉ．．．．．．ｔｔ－（??＾?！?！?！?８５?！＼ＭｒＭ?Ｍ?Ｍ?！??！?！?ｉ?！?ｙ；！！！！?Ｍ?！?ｉ?！?Ｉ??〇—………〇ｉ—??－ｌｌ?ｉ?ｉ?：??－ｉｌ：?：：：：：：！：??２００?３００?４００?５００?６００?２００?３００?４００?５００?６００?７００?８００?９００?１０００?１１００??波长（ｎｍ）?波长（ｎｍ）??图１－１曲安奈德样品溶液的紫外光谱?图１－２空內辅料的紫外光谱??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ＴＡ?Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?ａｄｊｕｖａｎｔ??１．２方法学??１．２．１专属性??按“１．２色谱条件”得到三种样品色谱图见图２－１、２－２、２－３。由色谱图
１．１?ＴＡ检测波长及含量测定方法的建立??１．１．１检测波长的确定??由所得紫外吸收图谱图１－１和图１－２可见，ＴＡ在２４０?ｎｍ处有峰值吸收，??而空白辅料在峰值２４０?ｎｍ处略有吸收。因此推知，若选用紫外分光光度计对??ＴＡ进行含量的测定，空白辅料在峰值处的吸收，必将对ＴＡ含量的测定会造成??一定的干扰。显然，本实验选用紫光分光光度计测量ＴＡ的含量是不可行的。??因此，本实验特选择高效液相色谱法（ｈｉｇｈ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，??ＨＰＬＣ）对曲安奈德进行含量的测定。??：．．．．．Ｉ．．．．．．｜．．．．．．｜．．．．．．Ｉ．．．．．．：．．．．．．：—；—：．．．．．．?－??＿?／ｉｌ?ｉ?丨?ｉ?Ｖｔｉｌ－１．．．．．．！．．．．．．ｉ．．．．．．ｔｔ－（??＾?！?！?！?８５?！＼ＭｒＭ?Ｍ?Ｍ?！??！?！?ｉ?！?ｙ；！！！！?Ｍ?！?ｉ?！?Ｉ??〇—………〇ｉ—??－ｌｌ?ｉ?ｉ?：??－ｉｌ：?：：：：：：！：??２００?３００?４００?５００?６００?２００?３００?４００?５００?６００?７００?８００?９００?１０００?１１００??波长（ｎｍ）?波长（ｎｍ）??图１－１曲安奈德样品溶液的紫外光谱?图１－２空內辅料的紫外光谱??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ＴＡ?Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ＵＶ－Ｖｉｓ?ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?ａｄｊｕｖａｎｔ??１．２方法学??１．２．１专属性??按“１．２色谱条件”得到三种样品色谱图见图２－１、２－２、２－３。由色谱图
辅料的HPLC色谱图
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本文编号：
2880234
