高效低毒抗菌肽的从头设计、筛选及生物活性研究

发布时间：2020-11-12 08:28

　　 抗生素滥用导致细菌和真菌耐药性成为不可忽视的问题。抗菌肽由于其独特作用机制,细菌和真菌不易对其产生耐药性,具有开发成新型抗生素的潜力。但是天然抗菌肽往往存在活性不高、提取过程复杂等不足,限制了抗菌肽的开发应用。人工设计多肽是获取新型抗菌肽的一种有效途径。本研究从实验室开发的抗菌肽库设计软件V1.0设计获得的肽库中随机挑选100条多肽序列,进行固相合成。通过抑菌实验测试了100条多肽的抗菌活性,从中筛选出一条广谱高抑菌活性的抗菌肽,将其命名为SAMP1。对抗菌肽SAMP1进行结构优化,筛选到更加高效低毒的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4。抑菌实验结果显示,抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4对热带念珠菌的最小抑菌浓度均为3.9μg·mL~(-1),对单增李斯特菌的最小抑菌浓度分别是3.9μg·mL~(-1)和0.95μg·mL~(-1)。溶血实验结果显示,当SAMP1-A3和SAMP1-A4浓度为62.5μg·mL~(-1)时,引起溶血率分别为0%和2.7%。细胞毒性实验结果显示,当SAMP1-A3和SAMP1-A4在40×MIC浓度下处理24h后,并未造成HUVEC细胞死亡。浓度在125μg·mL~(-1)以下时,SKOV3细胞生长不受影响,说明抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4对哺乳动物细胞没有毒性。因此,SAMP1-A3和SAMP1-A4是抗菌活性强、生物安全性高的抗菌肽。稳定性实验结果表明:SAMP1-A3和SAMP1-A4在80℃下加热30min抑菌活性不变,在pH2.0~8.0范围内处理1h后活性不变,25%血浆处理6h后抑菌活性不变,但对胰蛋白酶敏感。圆二色谱结果显示,在50%体积分数的TFE溶液中,SAMP1-A3和SAMP1-A4的α-螺旋比例增加。利用扫描电镜、透射电镜和流式细胞术实验研究抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4的作用机制。发现抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4引起热带念珠菌和单增李斯特菌细胞膜破裂,内容物泄露致使病原菌死亡;抗菌肽SAMP1-A4可以破坏单增李斯特菌细胞器结构,细胞膜形成损伤。综上所述,本研究获得了到两条高效低毒且具有较高稳定性的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4,并证明其通过破坏病原菌细胞膜完整性而发挥抗菌作用。
【学位单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R91
【部分图文】：

第三章 结果与分析×MIC（3.9μg·mL-1）浓度的 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 的 SD 培养基中，测试线。结果如图 3-1 所示，在 1×MIC 浓度下，两种抗菌肽发挥抗菌作用过程具赖性，在作用 1 h 后抗菌速率提升，在 4 h 内使热带念珠菌完全死亡，所以两对热带念珠菌都具有杀菌作用。

图 3-2 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 处理后单增李斯特菌生长曲线ig.3-2 Growth curve of L.monocytogenes post-treatment of SAMP1-A3 and SAMP1-AAMP1 及其类似肽的溶血毒性了评估肽对哺乳动物细胞的细胞毒性，在不同肽浓度下测定了对人类红细胞分比（表 3-3）。结果显示，经过序列重排后正电荷氨基酸残基聚集在 C 端的AMP1-A1 和正电荷氨基酸残基均匀分布的类似肽 SAMP1-A2 溶血毒性升高荷氨基酸残基聚集在 N 端的类似肽 SAMP1-A3 溶血毒性降低。用 Arg 替换类似肽 SAMP1-A4 与抗菌肽 SAMP1 相比溶血毒性降低。用 Val 作为疏水性基的类似肽 SAMP1-A7 溶血性降低，而用 Trp 作为疏水性氨基酸残基的序-A8 显示出溶血毒性增加，表明序列中加入色氨酸残基可能会引起人红细胞

图 3-3 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 处理后 HUVEC 细胞形态Fig. 3-3 HUVEC cell morphology after treatment with SAMP1-A3 and SAMP1-A4.6.2 对 SKOV3 卵巢癌细胞的毒性目前已见报道的抗菌肽，不仅具有广谱抑菌活性，还对癌细胞具有杀灭作用，具开发成新型抗癌药物的巨大潜力。使用 MTT 法测定不同浓度的抗菌肽 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 对 SKOV3 卵巢癌胞的生长抑制情况，评估两种抗菌肽的抗癌作用。结果如图 3-4 所示，SAMP1-A3 SAMP1-A4 对 SKOV3 卵巢癌细胞杀伤作用并不明显，当多肽浓度高达 3000μg·mL-1，SKOV3 卵巢癌细胞存活率仍为 67%和 75.6%。当多肽浓度在 125μg·mL-1以下时，细胞生长完全不受影响。由此可见，虽然 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 对真菌和细菌有高效抑菌活性，但对癌细胞的生长抑制作用并不大。
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本文编号：2880518