研究背景和目的细胞色素P450s(cytochrome P450 enzymes,CYPs)是人体重要的药物代谢酶,主要分布在肝脏、小肠和肾脏,其药物代谢量占人体总药物代谢量的75%以上。CYPs的基础表达和酶活性呈现明显的个体差异,可导致药物代谢以及清除速率的个体间差异,显著影响临床用药的安全性及有效性。健康与疾病的发育起源学说(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD)源于20世纪90年代,该学说认为个体发育关键时期(宫内发育阶段、新生儿期和儿童期)对营养物质、有毒化学物质、药物、感染等环境因素高度敏感,以至于改变对机体生理功能非常重要的基因表达,进而导致成年后对慢性疾病易感及药物代谢能力的长期改变。过去40年中许多重大疾病和功能障碍疾病发生率大幅增加,其部分原因可能与发育早期暴露营养不均衡、有毒化学物质、炎症等环境因素有关。母体感染与炎症是孕期常见的一种并发症,会对儿童发育和健康产生很大影响。已有研究报道炎症状态可下调大多数药物代谢酶(drug-metabolizing enzymes,DMEs)的表达。有研究发现小鼠孕期暴露脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可下调胎盘和胎鼠肝脏中Cyp3a11 mRNA和蛋白表达水平,然而孕期暴露LPS对子代鼠肝脏Cyp3a11及其它药物代谢酶基因表达的长期影响仍未见报道。孕烷X受体(pregnane X receptor,Pxr)是肝脏中重要的转录调控因子,可调控肝药物代谢酶的基础表达及介导由外源物引起的CYPs同工酶的诱导表达。转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是炎症反应期间重要的调节因子。炎症刺激可以通过将NF-κB p65亚基与类视黄醇X受体(retinoid X receptor,RXR)结合来调节Pxr对代谢酶表达的调控作用。以往研究多基于炎症对代谢酶表达的短期影响,有关对子代长期影响的研究尚无报道。阐明发育早期暴露炎症可能产生的长期影响,对指导临床合理用药具有十分重要的意义。本课题拟从DOHaD学说的角度探讨小鼠孕期暴露LPS是否影响不同年龄子代小鼠肝药物代谢酶基因的表达,并填补有关孕期发生炎症对药物代谢长期影响的认知不足,为合理用药提供新策略。该研究主要从以下两个方面展开:(1)孕期暴露LPS对10天龄(新生儿期)、30天龄(青少年时期)和60天龄(成年期)子代鼠肝药物代谢酶及炎症相关基因表达的影响。(2)孕期暴露LPS对子代鼠肝代谢酶发育模式的影响。研究方法以C57BL/6小鼠为研究对象,建立LPS炎症模型,生理盐水为溶媒对照。C57BL/6雌鼠在孕期第10天随机分为两组,分别单剂量腹腔注射100μg·kg~-11 LPS或10 ml·kg~(-1)生理盐水。在子代小鼠出生后第10、30和60天收取其肝脏组织,使用TR-qPCR检测炎症相关基因(NF-κB和IL-6)、核受体(Pxr、Ahr和Car等)及药物代谢酶(Cyp3a11、2b10、1a2、Sult1e1和Ugt1a1等)mRNA表达;采用Western-Blot技术检测Cyp3a11和1a2的蛋白表达水平。研究结果1.孕期暴露LPS对不同年龄子代鼠肝脏中炎症相关基因NF-κB与IL-6 mRNA表达水平的影响与同龄对照组相比,LPS处理组10天龄子代雌性小鼠肝脏中NF-κB与IL-6 mRNA表达水平高于对照组,而60天龄却显著低于对照组(n=4-6/组,P0.05);30天子代雄性小鼠肝脏中NF-κB mRNA表达水平显著高于对照组,而60天龄组却显著低于对照组(n=5-11/组,P0.05)。LPS处理组,10和30天龄子代雄性小鼠肝IL-6 mRNA表达水平高于对照组,60天龄低于对照组,但无统计学意义。2.孕期暴露LPS对新生儿期子代鼠肝核受体及药物代谢酶表达的影响:mRNA表达水平:与对照组相比,处理组10天龄子代小鼠肝核受体Pxr、Car及代谢酶Cyp3a11、1a2、2ab10、Ugt1a1和Sult1e1的mRNA表达水平均显著升高(n=4-8/组,P0.05)。该结果与炎症因子NF-κB与IL-6 mRNA表达水平相一致。蛋白表达水平:与对照组相比,处理组10天龄子代小鼠肝代谢酶Cyp3a11和1a2蛋白表达水平显著升高,与mRNA相对表达水平一致(n=4-8/组,P0.05)。3.孕期暴露LPS对青少年时期子代鼠肝核受体及药物代谢酶表达影响:mRNA表达水平:与对照组相比,30天龄子代雌雄小鼠肝代谢酶Cyp1a2和Sult1e1 mRNA表达水平显著性升高;肝核受体Car和代谢酶Cyp3a11 mRNA表达水平显著性降低(n=4-11/组,P0.05)。雌性小鼠肝Ugt1a1 mRNA表达水平明显低于对照组(n=4-11/组,P0.01);雄性小鼠肝Ugt1a1 mRNA表达水平无变化(n=4-11/组P0.05)。Cyp2ab10 mRNA表达水平仅在雄性小鼠中显著高于对照组(n=4-11/组,P0.01),而在雌性小鼠中无统计学意义。肝核受体Ahr表达水平仅在雄性小鼠中显著降低(n=5-11/组,P0.01),而Pxr和Car的mRNA表达处理组与对照组无统计学意义。蛋白表达水平:相对于对照组,30天龄子代雌雄小鼠肝代谢酶Cyp3a11蛋白表达水平显著性降低;子代雄鼠肝代谢酶Cyp1a2蛋白表达水平显著性升高(n=4-8/组,P0.05)。与对应基因的mRNA相对表达水平一致。4.孕期暴露LPS对成年期子代鼠肝核受体及药物代谢酶表达影响:mRNA表达水平:与对照组相比,处理组60天龄子代雌雄小鼠肝代谢酶Cyp1a2、2b10和Ugt1a1 mRNA表达水平显著降低(n=5-6/组,P0.05)。雌性小鼠肝核受体Pxr和代谢酶Cyp3a11、Sult1e1 mRNA表达水平明显高于对照组(n=5-6/组,P0.01);而雄性小鼠中无统计学意义。处理组雌性小鼠肝核受体Car mRNA表达水平显著高于对照组(n=5-6/组,P0.001),而在处理组雄性小鼠中低于对照组(n=4-6/组,P0.05)。蛋白表达水平:与mRNA相对表达水平一致,处理组子代雌性小鼠肝代谢酶Cyp3a11蛋白表达水平显著高于对照组,Cyp1a2蛋白表达水平低于对照组(n=4-8/组,P0.05);处理组雄性小鼠肝代谢酶Cyp3a11蛋白表达水平显著性降低,Cyp1a2蛋白表达水平显著性升高(n=5-7/组,P0.05),该结果与mRNA相对表达水平不一致。5.孕期暴露LPS对子代鼠肝核受体及药物代谢酶发育表达模式的影响:子代雌性小鼠:在对照组子代雌鼠中,核受体Pxr、Ahr、Car和代谢酶Cyp3a11、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表达水平较高;代谢酶Cyp1a2、2b10在成年期表达水平较高。对于处理组子代雌鼠,核受体Ahr mRNA表达水平在新生儿期表达水平较高;核受体Pxr和代谢酶Cyp1a2、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表达水平较高;核受体Car和代谢酶Cyp3a11、2b10在成年期表达水平较高。子代雄性小鼠:在对照组子代雄鼠中,核受体Pxr、Ahr、Car和代谢酶Cyp3a11、2b10、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表达水平较高;代谢酶Cyp1a2在成年期表达水平较高。对于处理组子代雌鼠,核受体Ahr mRNA表达水平在新生儿期表达水平较高;核受体Pxr和代谢酶Cyp1a2、2b10、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表达水平较高;代谢酶Cyp3a11在青少年期和成年期表达水平较高;核受体Car在新生儿期和青少年期表达水平较高。6.子代鼠肝脏中NF-κB与代谢酶相关基因在mRNA表达水平的相关性在对照组子代小鼠肝脏中,NF-κB与Pxr、Car、Cyp2b10、Ugt1a1和Sult1e1在mRNA表达水平的相关性很低(|r|0.23),且无统计学意义;处理组子代小鼠中,NF-κB与Pxr在mRNA表达水平存在中度正相关性(r=0.47,P0.001);与Car存在弱负相关性(r=-0.31,P0.05);与Cyp2b10存在中度正相关性,(r=0.43,P0.01);与Ugt1a1存在弱正相关(r=0.33,P0.01)。7.子代鼠肝脏中Pxr与代谢酶相关基因在mRNA表达水平的相关性在对照组子代小鼠肝脏中,Pxr与Cyp3a11在mRNA表达水平存在高度正相关性(r=0.74,P0.001);与Cyp1a2 mRNA表达无相关性(r=0.09);与Sult1e1存在中度正相关性,(r=0.55,P0.01);与Ugt1a1存在中度正相关(r=0.59,P0.01)。在处理组子代小鼠中,Pxr与Cyp3a11在mRNA表达水平存在弱正相关性(r=0.4,P0.01);与Cyp1a2存在高度正相关性(r=-0.79,P0.001);与Sult1e1存在弱正相关性,(r=0.28);与Ugt1a1存在高度正相关(r=0.72,P0.001)。研究结论孕期暴露LPS显著影响子代鼠肝脏中炎症相关基因(NF-κB和IL-6)、核受体(Pxr等)及代谢酶(Cyp3a11等)的表达水平,且存在性别差异。1.孕期暴露LPS对同一年龄的子代鼠肝核受体与代谢酶具有不同程度的上调或下调作用。2.孕期暴露LPS对不同年龄子代鼠肝脏中相同的代谢酶基因具有不同程度的上调或下调作用,且干扰子代小鼠肝发育成熟过程中代谢酶的发育表达模式。3.孕期暴露LPS,其子代鼠肝脏中NF-κB与Pxr、Car、Cyp2b10和Ugt1a1mRNA表达水平存在相关性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：
60 天龄显著降低（图 1A）；30天龄子代雄性小鼠肝 NF-κB mRNA 表达水平显著升高，60 天龄显著降低（图1B）。10 天龄子代雌性小鼠肝 IL-6mRNA 表达水平显著升高，60 天龄显著降低（图 1C）。10 天龄子代雄性小鼠肝 IL-6 表达水平高于对照组，60 天龄低于对照组，但无统计学差异（图 1D）。
16图 2 孕期暴露 LPS 对 10 天龄子代鼠肝核受体及代谢酶 mRNA 表达的影响A：10 天龄子代雌鼠肝核受体及代谢酶 mRNA 表达水平（n=4-8/组）；B：10 天龄子代雄鼠肝核受体及代谢酶 mRNA 表达水平（n = 4-8/组）。*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs. NC-10。NC-10：对照组 10 天龄子代小鼠，LPS-10：处理组 10 天龄子代小鼠。4.2.2 孕期暴露 LPS 对 10 天龄子代鼠肝 Cyp3a11 及 1a2 蛋白表达的影响为探究孕期暴露 LPS 对 10 天龄子代小鼠肝脏代谢酶 Cyp3a11 和 1a2 蛋白表达水平的影响。使用 Western-Blot 技术检测 10 天龄子代小鼠肝代谢酶 Cyp3a11和 1a2 蛋白表达水平。结果表明：与对照组相比，孕期雌鼠给予 LPS 处理后，其 10 天龄子代鼠肝脏代谢酶 Cyp3a11 和 1a2 蛋白表达水平均显著升高（图 3、4）。
图 3 孕期暴露 LPS 对 10 天龄子代鼠肝脏 Cyp3a11 蛋白表达水平的影响A：10 天龄子代雌性小鼠肝脏代谢酶 Cyp3a11 蛋白表达水平（n=4-5/组）；B：10 天龄子代雄性小鼠肝脏代谢酶 Cyp3a11 蛋白表达水平，（n=4-8/组）。*P<0.05**P<0.01vs.NC-10。NC-10：对照组 10 天龄子代小鼠，LPS-10：处理组 10 天龄子代小鼠。图 4 孕期暴露 LPS 对 10 天龄子代鼠肝脏代谢酶 Cyp1a2 蛋白表达水平的影响
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