兼具hGPx2和ApSOD活性的双功能酶在UAG工程菌中的表达

发布时间：2020-11-14 08:17

　　 过量的活性氧(ROS)水平对身体有害,ROS的形成和消除之间的不平衡在许多人类疾病的发病机理中起作用,例如缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、癌症和过敏等。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是用于预防ROS诱导的损伤的重要抗氧化酶。SOD催化超氧阴离子(O_2~(·-))歧化为氧气(O_2)和过氧化氢(H_2O_2),然后通过GPx将H_2O_2分解成水。这两种抗氧化酶除了具有协同的催化功能之外,它们又彼此保护,可以更有效地去除活性氧物质,保护细胞免受损伤,并维持活性氧物质的正常代谢。庞贝蠕虫来源SOD(ApSOD)是从海底热泉中的庞贝蠕虫中分离纯化的一种金属酶,其金属辅助因子为Cu和Zn。与人SOD(HsSOD)相比,ApSOD具有更高的稳定性,更适合科学研究和医学应用。人胃肠道来源GPx(hGPx2)是一种硒蛋白,硒蛋白的催化功能依赖于其活性中心的硒代半胱氨酸(Sec),天然的Sec由作为终止密码子的UGA编码,而且需要复杂的编码机制才能将UGA低效的翻译为Sec。因此,细胞利用自身的机制很难大量表达外源含硒GPx。我们课题组在之前的研究中,利用半胱氨酸营养缺陷表达系统和单一蛋白质生产(SPP)系统联合应用来表达GPx,成功的将Sec替代Cys插入到肽链中获得了较高活力的含硒GPx,然而这种方法只能获得缺失Cys的突变体,再加上成本高且耗时,不利于对含硒蛋白的广泛研究。本研究为了制备具有协同作用的hGPx2和ApSOD活性的双功能酶,选择了一段含21个氨基酸的柔性肽Ser(Gly4Ser)*4作连接Linker,其中甘氨酸分子量最小,肽链最短,可提高Linker的柔性度,而丝氨酸是亲水性最强的氨基酸,利于蛋白保持可溶性。本研究选用的Linker比本课题组之前使用的增加了5个氨基酸GGGGS,适当延长Linker可能更有利于减弱hGPx2和ApSOD对彼此结构的影响。先用基因工程方法获得hGPx2和ApSOD基因,再将两者构建在分泌型原核表达载体pRSF Duet-1上,然后,将构建成功的质粒与装载Sec掺入蛋白质的组件的质粒共转化UAG工程菌,在亚硒酸钠存在下诱导表达。UAG工程菌即琥珀型终止缺陷大肠杆菌C321.ΔA.exp,是将大肠杆菌中负责UAG终止的释放因子1(RF1)去除,并将基因组中321个UAG终止密码子替换为UAA终止密码子的工程菌,使得UAG在这一菌株中真正地被赋予编码氨基酸的能力。最终通过镍亲和层析法分离纯化出具有协同作用的hGPx2和ApSOD活性的双功能融合蛋白。该融合蛋白具有更高的GPx和SOD活性。每种酶都具有特定的不可替代的功能,它们以协同的方式起作用,更好地保护机体免受损伤。因此,多功能抗氧化剂的设计和生成将成为人工酶领域发展的重要课题。我们预期具有协同作用的肽酶有望用于治疗人类疾病,并且在医学中作为有效的抗氧化剂具有潜在的应用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R915
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 活性氧
        1.1.1 活性氧概述
        1.1.2 活性氧的产生与代谢
        1.1.3 活性氧与健康
    1.2 硒与硒蛋白
        1.2.1 硒的概述
        1.2.2 硒蛋白
        1.2.3 硒蛋白与健康
        1.2.4 Sec的生物合成
        1.2.5 Sec掺入蛋白质的机制和调节
    1.3 谷胱甘肽过氧化物酶
    1.4 超氧化物歧化酶
    1.5 具有协同作用的抗氧化模拟酶
    1.6 立题依据
第2章 实验内容
    2.1 实验试剂
    2.2 实验仪器
    2.3 实验菌株
    2.4 试剂配制
    2.5 实验方法
40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒的构建'>        2.5.1 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒的构建
        2.5.2 融合蛋白的含硒表达
        2.5.3 镍亲和层析法纯化蛋白
        2.5.4 目的蛋白的SDS-PAGE和Western Blot鉴定
        2.5.5 蛋白含量的测定
        2.5.6 蛋白活力测定
第3章 实验结果
40UAG-Linker-Ap SOD质粒的构建'>    3.1 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD质粒的构建
40UAG-Linker-Ap SOD基因'>        3.1.1 重叠PCR获取h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD基因
40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒'>        3.1.2 构建p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒
40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒'>        3.1.3 鉴定p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重组质粒
40UAG-Linker-Ap SOD质粒的表达及纯化'>    3.2 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD质粒的表达及纯化
40UAG-Linker-Ap SOD的浓度及活力测定'>    3.3 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD的浓度及活力测定
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
创新点
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 SUN JianGuo;GRAETER Stefan V;TANG Jian;HUANG JingHuan;LIU Peng;LAI YuXiao;YU Lin;MAJER Günter;SPATZ Joachim P;DING JianDong;;Preparation of stable micropatterns of gold on cell-adhesion-resistant hydrogels assisted by a hetero-bifunctional macromonomer linker[J];Science China(Chemistry);2014年04期

2 ;Design and optimization of a linker for fusion protein construction[J];Progress in Natural Science;2009年10期

3 张明明;洪理泉;卢仁泉;郑佐娅;;cTnI-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定[J];现代检验医学杂志;2007年01期

4 魏枫,刘虹,任秀宝;sCD80-Linker-sCD40L融合基因腺病毒载体的构建[J];天津医科大学学报;2004年02期

5 李增山,隋延仿,姜永强,雷祚荣,尚继栋;人CD80-Linker-SEA重组毒素的设计及生物学特性预测[J];中国免疫学杂志;2001年01期

6 龚隆财;罗镇明;杨雁青;王振宇;向军俭;王宏;;cTnI-linker-TnC融合蛋白的原核表达及鉴定[J];中国生物工程杂志;2015年04期

7 陈丽娟,盛瑞兰,许家仁,钱思轩,吴雨洁;成人急性淋巴细胞白血病Linker方案疗效总结[J];江苏医药;2001年04期

8 高峰;赵春;陈亚军;;EGF-linker-PE40重组毒素的构建、表达及其意义[J];实验与检验医学;2010年05期

9 张青松;路平;查刘生;马敬红;梁伯润;;Surface Properties of the Microgels Based on N-isopropylacrylamide and Tert-butyl Acrylate by Using N,N′-methylene-bis(acrylamide) and Clay as Cross-linker[J];Journal of DongHua University;2006年05期

10 ;Assembly of gold nanoparticles with H_(10)TTPR (3a, 4, 5, 8, 9, 9a, 10, 11-octa-hydro-2H,3H-1,6,7,12-tetrathia-perylene) as the rigid cross-linker[J];Chinese Science Bulletin;2004年08期

相关博士学位论文 前10条

1 李玉卫;纤维素酶系PT-box Linker的功能研究和新型β-糖苷酶的性质研究[D];吉林大学;2018年

2 李咏梅;重组免疫毒素EGF-Linker-TCS的制备及其靶向抗肿瘤效果的评价[D];第一军医大学;2007年

3 杨海文;靶向抗肿瘤EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白的研制及其生物活性研究[D];南方医科大学;2008年

4 李媛;基于血栓调节蛋白的抗炎措施研究[D];第三军医大学;2010年

5 陈丽萍;PIP_2调控KCNQ2通道的分子机制研究[D];中国科学院上海药物研究所;2016年

6 赵宝华;抗α毒素单链抗体的基因克隆和表达及其生物学特性研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年

7 王衡;鸡传染性支气管炎免疫增强型核酸疫苗的构建与免疫保护机理的研究[D];东北农业大学;2009年

8 王小飞;Anti-CRISPR蛋白AcrF3抑制I-F型CRISPR-Cas系统的分子机制研究[D];浙江大学;2018年

9 杨飞飞;新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的设计合成及其抗癌活性研究[D];华东师范大学;2014年

10 何天稀;抗癌药物靶向输送与双重响应控释载体设计与制备研究[D];清华大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 吕秀秀;兼具hGPx2和ApSOD活性的双功能酶在UAG工程菌中的表达[D];吉林大学;2019年

2 王雅楠;兼具GPx2和ApSOD活性抗氧化酶的真核表达及活性研究[D];吉林大学;2017年

3 魏枫;sCD80-Linker-sCD40L融合基因腺病毒载体的构建及鉴定[D];天津医科大学;2004年

4 刘军;含荧光团的双核铁硫簇的合成与性能研究[D];大连理工大学;2013年

5 庞明培;靶向RGD轴向修饰酞菁硅的合成和生物评价[D];天津科技大学;2017年

6 王书岸;具有GPx4和ApSOD活性的双功能酶的原核表达及活性研究[D];吉林大学;2016年

7 马文涛;猪白细胞介素2/6嵌合基因的融合表达及活性研究[D];河南农业大学;2011年

8 马元春;条件性表达YY1真核表达载体的构建及鉴定[D];西北农林科技大学;2013年

9 韩小艳;Linker长度对MDC和CVB3VP1融合基因疫苗免疫效果的影响[D];河北医科大学;2007年

10 谷珊;类鞘糖脂的合成[D];长春理工大学;2013年

本文编号：2883267