药物对活细胞初级纤毛影响的高通量筛选方法的构建与验证

发布时间：2020-11-14 12:41

　　 目的:初级纤毛是一种进化上高度保守,存在于哺乳动物大部分细胞表面的,呈毛发状的细胞器。其作为细胞的物理化学感受器和信号转导中心,调控着细胞的增殖、极性、迁移和侵润等生理病理过程。完整的结构及正常的装配和解聚是初级纤毛行使其生物学功能的基础。纤毛缺失、纤毛相关基因的突变等均会引起纤毛功能障碍,导致纤毛病的发生。最近研究发现,大量已知化合物对初级纤毛的组装与解聚有潜在影响,并会进一步影响恶性肿瘤、多囊性肾病等纤毛相关疾病的进展。而目前国内外的纤毛体外研究模型,在鉴定大量药物对初级纤毛完整性影响方面,都存在一定局限性。因此,本课题通过构建基于荧光显微镜及相关分析软件的高通量筛选方法,来筛选和鉴定在活细胞中对于纤毛组装和拆卸有影响的化合物,以期更经济高效地从现有药物中筛选出能影响纤毛结构和功能的药物、发现可能对纤毛病有影响的化合物。方法:在调研文献后选择ARL13B、SMO及MCHR1作为标记初级纤毛的标签蛋白,采用基因工程技术构建稳定转染的hTERT-RPE1-ARL13B-EGFP、hTERTRPE1-SMO-EGFP、hTERT-RPE1-MCHR1-TdTomato细胞株。通过检测标签蛋白与纤毛标志蛋白的共定位情况、稳定转染细胞株中纤毛对血清刺激响应的灵敏度等方式验证稳定转染细胞株中初级纤毛的结构与基本功能。经过验证后,再根据血清诱导不同密度细胞的纤毛的解聚,模拟药物促进纤毛分解的效果,以初步构建高通量筛选影响纤毛完整性的药物的方法。最后通过测试几种已报道的能显著影响纤毛分解的药物对该方法进行检验,进一步验证并优化了该筛选方法。结果:采用分子克隆方式构建的三种稳定转染的细胞株中,带荧光标签的ARL13B、SMO及MCHR1蛋白均定位于hTERT-RPE1细胞的初级纤毛上,且基本不影响初级纤毛的正常组装、解聚及对外界刺激的响应。构建的基于ImageXpress成像系统及相关软件的,在活细胞中进行的自动化高通量筛选方法,在细胞密度合适时,能有效分析鉴定出对纤毛解聚有显著促进或抑制作用的药物。结论:本课题构建了药物对活细胞中初级纤毛完整性影响的高通量筛选细胞模型,及其自动化分析方法,经验证本方法基本能鉴别显著影响纤毛拆卸的药物。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

2图 1.1 纤毛的结构示意图。（a）纤毛是由纤毛膜、轴丝和基体组成的毛发状细胞器。根据的结构不同，纤毛可分为三类：（b）初级纤毛，轴丝为“9×2 + 0”结构，由 9 对外周双微管与连接丝组成。（c）运动纤毛，由 9 对双联体微管、内/外动力蛋白臂、辐条及 1 对中管组成，为“9×2+2”结构。（d）节点纤毛，轴丝为“9×2 + 0”结构，由九对双重微管接丝和内/外动力蛋白臂组成。Fig 1.1 Schematic diagrams of cilium structure. (a) Cilia is a hair-like organelle composed ciliary membrane, axoneme, and basal body. (b) Primary cilia: the axoneme is "9x2+0" struconsisting of nine pairs of doublet microtubules and nexin. (c) Motile cilia consist of 9 pairs of dmicrotubules, inner/outer dynein arms, radial spoke and a pair of central singlet microtubules, wh"9x2+2" structure. (d) Node cilia: the axoneme is "9x2+0" structure, consisting of nine pairs of domicrotubules, nexin and inner/outer dynein arms.

江 苏 大 学 硕 士纤毛轴丝的结构基础是基体（或称为母γ 微管蛋白）构成，为轴丝 α、β 微管蛋白二轴丝外覆的纤毛膜是特化的细胞质膜，完全相同[1, 14]。最近的一项蛋白质组学研究表明，有六膜、纤毛基体及其相关附属结构上，这其中些受体蛋白，就像嵌在纤毛膜上的“探头”物理、化学或生物信号分子刺激，然后将信子效应器或 Hedgehog（Hh）[16-19]、Wnt[20-22等信号通路的相应下游信号蛋白，从而调控细胞分化等生理病理过程，具体作用模式如

进纤毛分解；还可激活 INPP5E55 来抑制纤毛发生[37]。而在分子机制方面，目前纤毛在正常或病理条件下分解的具体机制相对而言研究较为清晰的是，在体外研究中，由血清引起的细胞纤毛分机制如下：在加入血清后，解聚驱动蛋白成员 Kif2a 和 Kif24 被HEF1-Aurora A 途径迅速诱导纤毛轴质微管去稳定化和解聚合（图 1.3）看，该过程首先是 G2 / M 期激酶 Plk1 磷酸化，激活解聚驱动蛋白 Kif2延伸[38]。随后 Ndel1 稳定基底体中的 Trichoplein，与 Pitchfork 一起激活HEF1，进而激活组蛋白去乙酰化酶 6（HDAC6）、促进微管蛋白去乙酰致纤毛解聚（图 1.3）。最后，在 S 期和 G2 期表达的 Nek2 与定位于与的解聚驱动蛋白成员 Kif24 结合[39]，磷酸化并激活该第二解聚驱动蛋白期开始后拆解过程的不可逆性，保证了中心粒能够在 S 期复制并在 M 期裂纺锤体[35]（图 1.3）。
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本文编号：2883490