sFcγRⅡb蛋白表达及其结合肽筛选

发布时间：2017-04-06 07:09

  本文关键词：sFcγRⅡb蛋白表达及其结合肽筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：FcγRIIb为免疫球蛋白超家族成员,是唯一的抑制型Fc受体,主要通过与激活型受体交联向胞内转导抑制信号,对于体内的免疫平衡发挥着重要的作用。以FcγRIIb为靶点进行的研究对于探索自身免疫性疾病、感染以及肿瘤等疾病的发病机制及相关疾病的药物开发具有重要意义。本研究通过原核表达系统表达了FcγRIIb蛋白胞外区并利用噬菌体肽库展示技术筛选FcγRIIb结合肽,主要分为以下两部分:第一部分:s FcγRIIb基因克隆与表达。提取RBL-2H3细胞总RNA,采用RT-PCR技术克隆FcγRIIb基因,构建了克隆载体FcγRIIb-p UCm-T。我们亚克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒s FcγRIIb-p ET17b,采用Ca Cl2介导法将重组质粒s FcγRIIb-p ET17b转入大肠杆菌BL21(DE3)中,进行表达。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0m M,诱导时间为4h时蛋白表达效率最高。SDS-PAGE检测重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经Triton X-100和2M尿素清洗后,8M尿素溶液溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western Blot和ELISA法鉴定,结果表明重组蛋白s FcγRIIb能被特异性抗体所识别且与Ig G在体外具有结合能力,表明成功制备了具有正常生物学功能的重组蛋白。第二部分:s FcγRIIb结合肽筛选。采用噬菌体肽库展示技术对s FcγRIIb结合肽进行筛选。利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与s FcγRIIb蛋白亲和力,经过四轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,得到28种不同的十二肽序列。采用ELISA法鉴定噬菌体与s FcγRIIb蛋白的结合活性,获得了与s FcγRIIb蛋白高亲和力和高特异性结合的结合肽:FHKMPWYMSMYY、WHNPMWWSWNKN、MSHHSYYRDPFA、WHTTWPFWIVNS、LMAPHSHYVVRM。本研究成功制备了具生物学活性的重组蛋白s FcγRIIb,获得了高特异性、高亲和力的s FcγRIIb蛋白结合肽,为进一步研究结合肽功能奠定了基础。
【关键词】：sFcγRIIb 噬菌体展示技术 结合肽
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-18
• 1.1 FcγRIIb研究进展11-16
• 1.1.1 Fc受体（FcR）11
• 1.1.2 FcγRIIb基因与蛋白结构11-12
• 1.1.3 可溶性FcγRIIb12
• 1.1.4 FcγRIIb的生物学功能12-13
• 1.1.5 FcγRIIb与疾病相关13-15
• 1.1.6 FcγRIIb在疾病治疗中的作用15-16
• 1.2 噬菌体展示技术研究进展16-17
• 1.2.1 噬菌体展示技术16-17
• 1.2.2 噬菌体筛选多肽药物展望17
• 1.3 本研究的研究目的、内容与意义17-18
• 第2章 sFcγIIb蛋白的表达及活性鉴定18-40
• 2.1 实验材料18-21
• 2.1.1 细胞系18
• 2.1.2 菌种和质粒18
• 2.1.3 主要试剂18
• 2.1.4 主要仪器设备18-19
• 2.1.5 主要溶液19-21
• 2.1.6 培养基21
• 2.2 sFcγIIb原核表达载体的构建21-25
• 2.2.1 总RNA的提取21
• 2.2.2 反转录21-22
• 2.2.3 引物的设计与合成22
• 2.2.4 FcγIIB基因片段的PCR扩增22-23
• 2.2.5 目的基因FcγIIB与T载体的连接23
• 2.2.6 连接产物的转化：23-24
• 2.2.7 sFcγIIB基因片段的扩增24
• 2.2.8 目的基因sFcγIIB与pET17b载体的连接24-25
• 2.2.9 重组质粒pET-17b-sFcγIIB的双酶切鉴定25
• 2.3 sFcγIIb蛋白的表达与纯化25-29
• 2.3.1 利用软件在线对重组蛋白sFcγRIIb理化性质进行分析25
• 2.3.2 sFcγIIb蛋白的表达25-26
• 2.3.3 重组蛋白的纯化26
• 2.3.4 重组蛋白的复性26-27
• 2.3.5 Western Blot27
• 2.3.6 ELISA27-29
• 2.4 实验结果29-38
• 2.4.1 重组质粒的构建29-32
• 2.4.2 蛋白的诱导表达及纯化32-38
• 2.5 讨论38-40
• 第3章 sFcγRIIb蛋白结合肽的筛选40-50
• 3.1 实验材料40-41
• 3.1.1 试剂40
• 3.1.2 噬菌体筛选材料40-41
• 3.2 实验方法41-45
• 3.2.1 噬菌体滴度的测定41
• 3.2.2 噬菌体肽库淘选41-42
• 3.2.3 第二、三、四轮噬菌体淘选42-43
• 3.2.4 每轮洗脱噬菌体与sFcγRIIb蛋白亲和力的鉴定43
• 3.2.5 噬菌斑的扩增43
• 3.2.6 噬菌体DNA的提取43-44
• 3.2.7 琼脂糖凝胶电泳检测噬菌体DNA44
• 3.2.8 单链噬菌体DNA序列的测定44
• 3.2.9 氨基酸序列同源性分析44
• 3.2.10 噬菌体与sFcγRIIb亲和力的ELISA鉴定44-45
• 3.3 实验结果45-48
• 3.3.1 筛选噬菌体回收率结果45
• 3.3.2 每轮噬菌体筛选后洗脱物与sFcγRIIb蛋白的结合45-46
• 3.3.3 挑取噬菌体单克隆并提取DNA46-47
• 3.3.4 单链噬菌体DNA序列测定结果47-48
• 3.3.5 噬菌体单克隆亲和力鉴定48
• 3.3.6 氨基酸序列同源性分析结果48
• 3.4 讨论48-50
• 第4章 结论50-51
• 参考文献51-56
• 致谢56

【参考文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 封雪;苦荞10kDa过敏原的重组表达及性质研究[D];西北农林科技大学;2013年

  本文关键词：sFcγRⅡb蛋白表达及其结合肽筛选，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：288454