降血压活性肽的融合表达及纯化

发布时间：2017-04-06 12:08

  本文关键词：降血压活性肽的融合表达及纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高血压疾病是造成心脑血管疾病死亡的主要原因,随着社会经济的发展和人们生活方式的变化,高血压疾病的患病率呈现持续增长的趋势。市场上用于治疗高血压的药物种类繁多,常见的有复方降压片、利血平等口服降血压药物,但是临床发现其存在副作用,容易引起心率减慢或者增快的症状。因此,以天然生物大分子——蛋白质为来源制备的降血压活性肽逐渐成为研究热点,它具有安全无毒、无副作用、对正常血压无影响且降压效果温和等优势。其作用机理是抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性,从而降低患者的血压。目前降血压活性肽的制备主要是采用蛋白酶水解法、微生物发酵法和基因工程法。其中,人们已经利用蛋白酶水解法和微生物发酵法成功分离鉴定出大量的降血压活性肽,但是酶水解产物成分往往过于复杂导致后续分离纯化过程困难,且适用的发酵菌种种类稀少,在一定程度上制约了这两种方法的发展。近期的研究结果表明,基因工程法在制备降血压活性肽方面具有巨大的发展潜力,但该法在技术实现方面还存在一些问题,限制其在实际操作中的应用。从基因表达角度来分析,一方面降血压活性肽序列通常较短,容易被工程菌体内蛋白酶降解,导致单体肽无法实现直接表达;另一方面由于蛋白质常常不能正确折叠而形成包涵体,复性过程费时费力。从蛋白纯化角度来分析,蛋白酶往往不能有效识别酶切位点,纯化标签去除困难。此外,亲和纯化介质较昂贵,一般要进行多步纯化,存在成本高、步骤繁琐和有毒试剂的使用等问题。针对基因工程法制备降血压活性肽存在的问题,本论文根据胃肠道消化酶的酶切特性和降血压活性肽的构效关系,选取经体内自发性高血压大鼠(SHR)实验或者体外胃肠消化模拟实验证实具有高活性的降血压活性肽,采用高效释放的串联结构作为连接片段,将20种降血压活性肽单体串联成降血压活性肽多聚体(AHPM),对AHPM基因优化分析后进行基因合成。其次构建重组表达载体p ET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM,转化宿主菌株,命名为大肠杆菌BL21(DE3)/p ET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM。基因测序结果显示AHPM被插入到L2(252-273)纯化标签的下游,在AHPM与L2(252-273)纯化标签之间有SUMO增溶标签,组成L2(252-273)-SUMO双融合标签。再将重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,研究结果表明,最适表达条件为37℃培养至菌液OD600值1.0,加入0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),降温至30℃诱导7 h,在此条件下,重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的表达量为254 mg/L发酵液,并且95%以上是以可溶形式表达。最后采用L2(252-273)-SUMO双融合标签纯化重组AHPM。利用L2(252-273)纯化标签与硅藻土助滤剂STD(简称硅藻土)之间强烈的特异性吸附作用,将硅藻土与含有重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的细胞破碎上清溶液混合,实验结果显示,温度为25℃,震荡速率为150 r/min,反应时间为2.0 h时,吸附率达到94.50%。接下来经过重组SUMO蛋白酶(Ulp1-K10)的酶切作用后,L2(252-273)-SUMO双融合标签和Ulp1-K10均被吸附到硅藻土上,AHPM被分离出来,AHPM得率可达31.68 mg/L发酵液。同时模拟两步胃肠消化实验结果表明,胃蛋白酶消化水解液以及胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶复合蛋白酶水解液均表现出较强的ACE抑制活性,其IC50值分别为56.22±1.03μg/m L和56.10±1.05μg/m L。本论文采用有效的串联策略、高效的表达系统和简易的纯化方法,成功纯化出高活性的降血压活性肽,为降血压活性肽的工业化生产提供了一个简便的方法,也为基因工程法制备其他生物活性肽提供了新的研究思路。
【关键词】：降血压活性肽 降血压活性肽多聚体 L2(252-273)-SUMO-AHPM 硅藻土 ACE抑制活性
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915;O629.72
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 绪论9-19
• 1.1 高血压与降血压活性肽理论9-11
• 1.1.1 高血压与人类健康的关系9
• 1.1.2 降血压活性肽理论9-11
• 1.2 降血压活性肽制备方法概述11-14
• 1.2.1 蛋白酶水解法制备降血压活性肽11-12
• 1.2.2 微生物发酵法制备降血压活性肽12-13
• 1.2.3 基因工程法制备降血压活性肽13-14
• 1.3 降血压活性肽多聚体的表达策略14-16
• 1.3.1 降血压活性肽的表达方式14-15
• 1.3.2 降血压活性肽的表达系统15-16
• 1.4 降血压活性肽多聚体的纯化16-17
• 1.4.1 降血压活性肽的传统纯化方法16
• 1.4.2 降血压活性肽的新型纯化方法16-17
• 1.5 立题背景及意义17-18
• 1.6 主要研究内容18-19
• 2 材料和方法19-26
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 菌株和培养基19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要仪器和设备19-20
• 2.2 实验方法20-26
• 2.2.1 降血压活性肽单体的筛选20-21
• 2.2.2 降血压活性肽多聚体的设计思路与基因合成21
• 2.2.3 分子克隆实验21
• 2.2.4 重组表达载体pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM的构建21-22
• 2.2.5 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的诱导表达22
• 2.2.6 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM诱导表达条件的优化22
• 2.2.7 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上的吸附特性研究22-23
• 2.2.8 重组SUMO蛋白酶在阳离子交换树脂上的吸附特性研究23-24
• 2.2.9 AHPM的纯化24
• 2.2.10 体外胃肠消化模拟实验24
• 2.2.11 SDS-PAGE24-25
• 2.2.12 蛋白浓度的测定25
• 2.2.13 多肽浓度的测定25
• 2.2.14 ACE抑制率测定25-26
• 3 结果与讨论26-40
• 3.1 降血压活性肽多聚体基因的设计、优化与合成26-29
• 3.1.1 降血压活性肽多聚体基因的设计26-27
• 3.1.2 降血压活性肽多聚体基因的优化分析27-28
• 3.1.3 降血压活性肽多聚体基因的合成28-29
• 3.2 重组表达载体pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM的构建29-31
• 3.2.1 携带目的基因质粒的酶切验证29
• 3.2.2 目的基因的PCR扩增29-30
• 3.2.3 重组表达载体的双酶切鉴定30
• 3.2.4 重组表达载体pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM构建完成30-31
• 3.3 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM的表达鉴定31-32
• 3.4 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM诱导表达条件的优化32-34
• 3.4.1 IPTG浓度单因素实验32
• 3.4.2 诱导时机单因素实验32
• 3.4.3 诱导温度单因素实验32
• 3.4.4 诱导时间单因素实验32-34
• 3.5 重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上的吸附研究34-35
• 3.5.1 pH对重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影响34
• 3.5.2 吸附容量对重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影响34
• 3.5.3 吸附时间对重组蛋白L2(252-273)-SUMO-AHPM在硅藻土上吸附的影响34-35
• 3.6 重组SUMO蛋白酶的纯化35-37
• 3.6.1 重组SUMO蛋白酶吸附时间的研究35-36
• 3.6.2 重组SUMO蛋白酶的梯度洗脱36-37
• 3.7 降血压活性肽多聚体的纯化37-39
• 3.8 降血压活性肽多聚体的活性鉴定39-40
• 主要结论与展望40-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-49
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：288834