CDK5介导替米沙坦对3T3-L1脂肪细胞PPARγ磷酸化修饰的影响

发布时间：2020-11-18 09:01

　　 目的1、明确炎性因子TNF-α是否具有影响3T3-L1脂肪细胞中PPARγ磷酸化修饰的作用。2、明确替米沙坦是否能拮抗TNF-α对PPARγ的影响。3、明确替米沙坦对脂肪细胞的作用是否确系依赖于蛋白激酶CDK5的活性及替米沙坦的作用位点。方法三步法诱导3T3-L1前脂肪细胞不断分化成为成熟脂肪细胞,肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)刺激成熟3T3-L1,以替米沙坦不同剂量进行分组干预(T0.1组,加入0.1μmol/L替米沙坦;T5组,加入5μmol/L替米沙坦;T10组加入10μmol/L替米沙坦;),蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)及其磷酸化水平。应用shRNA沉默未分化3T3-L1的PPARγ,应用逆转录病毒感染构建并筛选稳定表达PPARγ丝氨酸突变型3T3-L1细胞系,油红O染色异丙醇萃取实验评估脂肪细胞分化能力,WB检测确定其磷酸化位点及其上游激酶。shRNA沉默细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,CDK5),并以替米沙坦干预成熟3T3-L1,WB检测PPARγ及其磷酸化水平,ELISA检测培养基上清中脂联素释放量。结果1、三步法可成功建立3T3-L1前脂肪细胞分化模型,筛选的PPARγ各突变型细胞与野生型相比分化能力相当。2、替米沙坦影响PPARγ在3T3-L1中的磷酸化修饰,以不同剂量替米沙坦干预24h后各组pPPARγ表达水平均有所降低,其中T5及T10组降低显著,脂联素含量显著上升。3、western印迹结果显示与WT相比仅S273A细胞中PPARγ的磷酸化水平不再响应替米沙坦干预,即未见pPPARγ表达量降低,而S112A、S186A中pPPARγ表达量均下降。4、CDK5介导了替米沙坦对PPARγS273位磷酸化的抑制,沉默CDK5基因并筛选ΔCDK5-3T3-L1前脂肪细胞系(沉默CDK5的3T3-L1前脂肪细胞系),上述细胞诱导成熟后油红O染色结果表明:CDK5基因沉默后3T3-L1分化能力未受显著影响,但与对照组相比ΔCDK5-3T3-L1成熟脂肪细胞中替米沙坦降低PPARγ磷酸化水平的能力被显著抑制,与此同时培养基上清中脂联素表达显著升高。结论1、TNF-α刺激3T3-L1脂肪细胞导致的脂联素释放量下降是通过上调PPARγ磷酸化修饰水平进而影响其转录活性而非增加PPARγ表达水平实现的。替米沙坦可拮抗上述TNF-α作用。2、利用逆转录病毒进行基因沉默及定点突变技术成功构建一系列PPARγ磷酸化位点突变的3T3-L1细胞株。利用该细胞株确定替米沙坦的作用位点为第273位丝氨酸。3、按上述方法沉默CDK5基因并筛选ΔCDK5-3T3-L1前脂肪细胞系,CDK5基因沉默后3T3-L1分化能力未受显著影响但替米沙坦降低PPARγ磷酸化水平的能力被显著抑制。4、替米沙坦可抑制CDK5介导的PPARγ第273位丝氨酸磷酸化,从而上调脂联素表达水平,具有改善胰岛素抵抗作用,对替米沙坦改善炎症反应分子机制的明确,可以为此类药物早日应用于临床提供理论依据,填补目前T2DM药物预防领域的空白。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

15图 1 3T3-L1 前脂肪细胞正常分化各阶段细胞形态（200X）A：前脂肪细胞；B：接触抑制 48h；C：分化第 2 天；D：分化第 4 天；E：分化第 6 天；F：分化第 8 天Fig1. 3T3-L1 preadipocytes normal differentiation at various stages of cell morphology （200X）A：Preadipocytes; B：Contact inhibition 48h; C：Differentiation day 2; D：Differentiation day 4; E：Differentiationday 6; F：Differentiation day 8

PPAR-γ 的磷酸化修饰胞诱导分化成熟时加入 TNF止干预，收获脂肪细胞并检测estern 印迹结果显示，TNF-α 磷酸化修饰，且在诱导 30m峰值，随后磷酸化水平有所下NF-α0 15 30 60 120（minpPP

于 60min 达到峰值，随后磷酸化水平有所下降，见图 2图 2 TNFα 诱导不同时间对 PPARγ 磷酸化的影响Fig2. TNFα-induced PPARγ phosphorylation at different times米沙坦影响 PPARγ 在 3T3-L1 中的磷酸化修饰estern 印迹结果显示，成熟的 3T3-L1 中加入 TNF-α 刺激达未见显著变化，PPARγ 磷酸化水平明显增强。以不同 后各组 pPPARγ 表达水平均有所降低，其中 T5 及 T10 组显著上升，见图 3。TNF-α0 15 30 60 120（min）PPARγpPPARγ
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本文编号：2888550