高效杀灭单增李斯特菌噬菌体裂解酶的改造及其在检测中的应用研究

发布时间：2020-11-18 07:27

　　 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种食源性病原菌,革兰氏染色阳性,在人体内主要以胞内感染形式存在。单增李斯特菌感染后可以引起脑膜脑炎,菌血症和败血症。虽然庆大霉素、卡那霉素对单增李斯特菌有抑制作用,但是抗生素的滥用会导致耐药菌的出现,因此急需寻求新的抑菌因子。噬菌体裂解酶(Bacteriophage lysin)是噬菌体感染宿主后期表达的可以裂解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶类。天然的李斯特菌裂解酶不仅具有较强的种属特异性并且不易诱导细菌产生耐药性。但是天然李斯特裂解酶的活性大多比较低,因此急需发展高效的单增李斯特菌裂解酶。本研究通过将细胞穿透肽Tat与李斯特裂解酶Ply511融合发展了一种活性增强的李斯特裂解酶Ply511-N2。100μg/mL Ply511-N2能在60 min内使单增李斯特菌活菌数降低1-3个Log值,但是不能入胞杀菌。并且酶学性质表明,Ply511-N2能在温度为4-45℃和pH为6.0-11.0时保持良好的活性。Ply511-N2对李斯特菌有较高的特异性,对单增李斯特菌有良好的杀菌效果,对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和变异链球菌的活性较差。Ply511-N2在250μg/mL以下时对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)毒性较低,实验条件下细胞保持了超过90%的活性。目前检测李斯特菌的方法因仪器昂贵,操作复杂,无法满足现场快速检测的需求。本研究第二部分结合前一部分发展的裂解酶,利用生物体内ATP作为检测靶标发展了一种新型的李斯特菌检测方法,不仅特异性和灵敏性较高,而且简单易操作,不需要昂贵的仪器和专业的技术人员。由于Ply511-N2对单增李斯特菌具有较高的特异性,Ply511-N2检测单增李斯特菌时有ATP升高的现象,而检测金黄色葡萄球菌时没有ATP升高的现象。这种检测方法对单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到10~4-10~5 CFU/mL。下一步希望对这种检测方法做更多的优化。本研究通过细胞穿透肽Tat序列与Ply511序列融合表达发展了一个活性比亲本裂解酶增强的裂解酶,并利用该嵌合裂解酶发展了一种单增李斯特菌快速检测的新方法,为进一步探索基于噬菌体裂解酶的李斯特菌治疗和快速检测打下了基础。
【学位单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R91
【部分图文】：

重度污染食物约 20 h 后开始，李斯特菌在体内潜伏期大个体潜伏期更长[15]。在初始阶段，细菌主要在绒毛顶端后期大多数出现在肠绒毛的巨噬细胞中。但是致病性李道内形成明显的组织损伤[12]。表明单增李斯特菌不会在染。摄入后，单核细胞增生李斯特菌能够穿过肠上皮并更深的组织[16, 17]。在肠道中，通过细胞侵入到邻近的细障的李斯特菌被淋巴和血液携带到肠系膜淋巴结，脾脏特菌入侵肝脏后会被一些巨噬细胞杀死[12]。在最初感染表面的吞噬细胞即库普弗细胞（Kupffer cell）激起细胞菌，存活的细菌继续增殖[9]。在肝脏中细菌增殖的主要被认为是李斯特菌从肠道转移后的第一个靶器官[10]。单历完整的细胞内感染循环。在衰弱和免疫功能低下的患菌不受限制地增殖可能导致低水平的菌血症[9]，将会进例如脑和妊娠子宫[20]。

单核增生李斯特菌是胞内寄生菌。目前没有发现可以入胞杀死李斯特菌的裂解酶和抗生素，因此我们希望将一段能入胞的细胞穿透肽与现有的李斯特菌裂解酶融合表达，发展重组的噬菌体裂解酶。在本研究中我们采用了细胞穿透肽 Tat（YGRKKRRQRRR）和一段合成的细胞穿透肽（KAAILCRRLRD）与噬菌体裂解酶进行融合表达了 3 种蛋白，并测试了 3 种嵌合体杀灭胞外以及胞内菌的活性。只有重组蛋白 Ply511-N2 具有较好的杀菌活性，而且高于亲本裂解酶。但是，Ply511-N2 不能入胞杀菌。由于重组裂解酶 Ply511-N2 具有更好的活性和特异性，因此我们进一步将它用于单增李斯特菌的检测。本研究采取生物发光的原理，借助荧光素酶能与 ATP 发生反应的特性来检测环境中存在的李斯特菌。本实验根据细菌裂解时会释放出大量的 ATP 这一生物特性，建立一种能快速特异检测李斯特菌的方法（如图 1.2 所示）。该检测方法检测时间短，不需要长时间的增菌培养，不需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，能够区分活菌和死菌，有望应用于食品行业中单增李斯特菌的检测。本研究建立的检测方法仍然需要进一步的优化，提高对环境中单增李斯特菌定量的准确性。

武汉轻工大学硕士专业学位论文MTT 的配置：避光条件下，用分析天平精密称取 50 mg 的 MTT 粉末于 15mL 离心管中，加入 10 mL PBS，配置成 5 mg/mL ，PH 在 7.4-7.6 范围内的MTT 工作液。完全溶解后，用无菌 0.22 μm 的滤膜过滤后分装于棕色 1.5 mLEP 管中，-20℃ 保存，两个月内有效。使用前 37℃ 水浴解冻。引物的溶解：目的基因用离心机瞬时离心，按引物说明书加入对应体积的无菌蒸馏水，配置成 10 μM 的浓度，分装后-20℃保存，使用时可放 4℃暂时保存。2.3 重组裂解酶表达载体构建
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张正东;张玲;王红;陈曦;王艳;闫国栋;邹年莉;孙松松;;自贡市2014年农贸市场食品中单增李斯特菌污染状况调查[J];实用预防医学;2019年03期

2 张晶;白志军;和鹏;陶霞;吴新伟;;广州市58株单增李斯特菌菌株特征分析[J];现代预防医学;2019年05期

3 贾培;盛司潼;兰全学;;单增李斯特菌恒温荧光PCR检测方法的建立及应用[J];中国新技术新产品;2019年09期

4 武鑫;;食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展[J];食品安全质量检测学报;2019年18期

5 贾艳艳;何雷;郁川;余祖华;程相朝;张春杰;李银聚;;豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的检测[J];中国畜牧兽医;2014年11期

6 ;谨防单增李斯特菌污染的食物[J];食品与生活;2017年10期

7 乌日娜;刘翔;郭邦成;闫立群;张玉平;;银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究[J];安徽农业科学;2014年18期

8 范芸;胡云建;艾效曼;宁尚勇;程玮;李江涛;常乃柏;;一起血液病区单增李斯特菌病的爆发并文献复习[J];中华临床医师杂志(电子版);2013年04期

9 杨松;曲祖乙;刘永华;;单增李斯特菌定量检测方法研究[J];中国农学通报;2012年23期

10 李燕杰;朱小花;夏雨;袁根良;杨公明;;不同培养条件对单增李斯特菌生物被膜形成的影响研究[J];食品研究与开发;2010年11期

相关博士学位论文 前10条

1 刘玉申;单核细胞增生性李斯特菌可视化检测方法的建立与评价[D];吉林大学;2019年

2 王旭;基于比较基因组学和转录组学技术揭示单增李斯特菌毒力因子的研究[D];上海海洋大学;2016年

3 江玲丽;单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性[D];浙江大学;2006年

4 张辉;单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D];吉林大学;2008年

5 吴诗;食源性单增李斯特菌数值鉴定系统及其遗传多样性研究[D];华南理工大学;2016年

6 亢春雨;食源性单核增生性李斯特氏菌的分布、遗传多态性及其毒理机制研究[D];河北农业大学;2015年

7 陈谋通;食源性单核细胞增生李斯特菌遗传多样性分析和群体感应研究[D];华南理工大学;2014年

8 方春;单核细胞增生李斯特菌谱系Ⅲ强毒株与弱毒菌株比较基因组及致病力差异机制[D];浙江大学;2015年

9 林文凭;Bacillus subtilis ZJU15产生的抗菌肽研究[D];浙江大学;2010年

10 李丽;三种人兽共患病病原菌同步快速检测技术研究[D];吉林大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 韩笑;单增李斯特菌氧化还原蛋白YjbH调控的抗氧化应激和细菌感染机制研究[D];浙江农林大学;2019年

2 马天天;单增李斯特菌感染依赖溶血素LLO触发ERK1/2磷酸化机制研究[D];浙江农林大学;2019年

3 李庆辉;食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测[D];石河子大学;2019年

4 李琼;高效杀灭单增李斯特菌噬菌体裂解酶的改造及其在检测中的应用研究[D];武汉轻工大学;2019年

5 王亚鸽;一株多重耐药ST477型单增李斯特菌全基因组测序与比较基因组学分析[D];华南理工大学;2019年

6 谢灵扬;冷鲜肉冷链流通过程中单增李斯特菌活性影响的研究[D];浙江工业大学;2018年

7 王航;单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711以及鞭毛结构蛋白FlhB的生物学功能研究[D];浙江农林大学;2018年

8 石薇;免疫磁性糊精微球的制备及其快速分离检验单增李斯特菌的技术研究[D];山西农业大学;2017年

9 贺婷;三种天然抑菌剂对低温肉制品中单增李斯特菌的抑菌效果研究[D];成都学院;2018年

10 蒋兵;单增李斯特菌在猪、鸡肉品加工及销售过程中的污染情况及基因分型研究[D];西南大学;2018年

本文编号：2888473