从海藻和植物中发现抗菌和抗肿瘤活性化合物

发布时间：2020-11-19 23:32

　　 目前,新药尤其是抗生素,急切需要解决病原体抗性的问题,其中大自然拥有最丰富的新抗生素来源,因此,从天然资源中寻找具有显著生物活性的天然产物仍然是发现新药先导化合物的主要途径。此外,抗生素在生物工程合成领域和化学合成领域也有相当大的进步。海洋为海洋生物提供了巨大而多样的栖息地。海洋因其具有不断变化的温度,压力,盐度和金属浓度等因素,使得成为海洋植物和藻类产生新化合物的环境来源。独特的海洋环境中生长着种类繁多的海洋植物和藻类,这些生物能产生很多具有生物活性的天然产物,不少是在陆地上不曾发现的。独特的海洋生物使得海洋天然产物具有显著多样性。近几十年来,海洋天然产物因其多样的生物活性和用途而备受关注。据文献报道,已从海洋来源中分离出16000个天然产物,包括萜类化合物、甾体化合物、酚类化合物、生物碱-多糖复合物、多肽类化合物、聚酮类化合物、脂肪酸类化合物和甘油类化合物,到目前为止有6800篇出版物。海洋环境中包含数量众多的微观和宏观有机体种类,特别是海洋植物和藻类被证实具有产生结构独特的次级代谢产物的能力。植物在海洋世界中,在耐火生物材料的再循环上发挥重要的生态作用,并且在药学应用中能够生产新颖的次级代谢产物。尽管海洋微生物能产生多种次级代谢产物,它被认为是抗生素的顶级生产者,同时也是制药工业的重要提供者,但在生产抗生素的总量上,海洋植物占最大份额。海洋植物生长于各种环境中,其中不乏有生存压力,并且它们有能力产生次级代谢产物也是众所周知的。因此,海洋生物产生的次级代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地生物相比有着巨大的差异,导致海洋生物往往能够产生一些化学结构新颖、生物活性多样、显著的先导化合物,为新药研究提供大量的模式结构和药物前体。海洋是地球上最具多产的生态环境,生长其中的植物次级代谢产物具有相当高的多样性。自早些时候以来,许多研究人员着眼与从陆地到海洋或淡水的藻类化学成分,尤其是绿藻类,它们有望在营养品和制药行业中被开发利用为功能活性物质;在广泛的陆生植物上研究了这些绿藻代谢产物的化学性质。这些来自绿藻次级代谢产物的化学成分,已经在大量陆生植物中进行了研究。绿藻门(Chlorophyta)植物种类繁多,含有约4300个物种,其次级代谢产物的结构具有多样性,部分含有特定来源的特征性的功能基团。绿藻中所有具有生物活性的化合物如生物碱、萜类、类固醇、脂肪酸、甘油酯和多糖都因其具有膳食营养补充和药理活性而备受关注。营养微藻是一类种类繁多的微小植物,其包含介于50-70%之间相对高含量的蛋白质(畜肉蛋白含量为50%和小麦为15%-17%),30%的脂类,40%的甘油,以及平均含量较低的胡萝卜素(8%-14%)和维生素(B1、B2、B3、B6、B12、E、K、D等)。与其他植物或动物相比,微藻的生理和生物化学特征有较大不同,并且药用的藻类与其提取物具有不同程度的生物活性。其中包括抗肿瘤、抗原生动物、抗病毒、抗氧化剂、抑制人癌细胞系的细胞毒活性。在绿藻门(Chlorophyta)中,刚毛藻属(Cladophora)在分类学上较复杂,其包含许多种,有不少已被化学和药学研究。在这项研究中,我们选择了两个样本,其两种是收集来自中国东南部舟山的沿海植物,旋花滨Calystegia soldalla、蓬蘽 Rubus hirsutus thunb以及来自同一地区的绿藻Cladophora stempsonii。这项研究的目的是从和旋花滨和绿藻的次级代谢产物中,分离纯化得到具有生物活性的化合物。本论文的研究内容包括从旋花滨和绿藻中获取次级代谢产物。在我们项目组的努力下,通过使用不同的有机试剂去鉴别具有活性的化合物,以寻找抗生素以及其他来自海洋植物和藻类的具有药用和营养价值的化合物。随后,对三种样品的具有生物活性的新化合物进行评估和表征。旋花滨Calystegia soldanella、蓬蘽和绿藻Cladophora stempsonii使用3种不同的有机试剂提取;首先利用80%乙醇溶液提取浸膏,随后用水将浸膏进行分段,随后依次使用乙酸乙酯和正丁醇对浸膏进行提取。使用TLC在内的不同色谱技术对旋花滨Caalstegia soldnella和绿藻Cladophora stempsonii进行了研究和分离纯化。纯品化合物采用HPLC、UV和NMR鉴别。来自旋花滨Calysyegiasoldanella的化合物利用平板稀释法对绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌 Saphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 以及大肠杆菌Escherichiacoli进行了抑菌试验。除了抑菌试验,同时对化合物的抗氧化性(DPPH、FRAP)进行了测定。来自绿藻(Cladophora stempsonii)的化合物采用96孔板对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)进行了抑菌试验。将抑菌性较强的3个来自绿藻Cladophora stempsonii化合物命名为1、2和3号。其中对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(KlKbsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Eshherichia acoli)、枯草芽孢杆菌(Baacillus subtilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的最低抑菌浓度为 4.0 μg/mL、1.0 μg/mL、0.2 μg/mL、4.0 μg/mL 和 4.0μg/mL。化合物2对前4种病原菌的最低抑菌浓度分别为8μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和32.0μg/mL,对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)没有抑制活性。化合物3仅对3种病原菌有抑制作用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)最低抑菌浓度分别为64μg/mL、32 μg/mL和16 μg/mL。分离纯化来自于绿藻的化合物1通过1D-NMR和2D-NMR鉴定为胆固醇,通过2D-NMR鉴定化合物2为N-Phenethylisovaleramide以及医用GC-MS对绿藻中低极性的组分进行测定。旋花滨(Calystegia soldanella)和绿藻(Cladophora stempsonii)的正丁醇相浸膏利用TLC、柱色谱和Pre-HPLC进行了分离纯化。因为化合物量少而无法确定所有纯品化合物结构。植物内生真菌是寄生在健康植物组织和各器官内部,并不引起寄主表现任何症状的一类真菌。在进化中,因其次生代谢产物可与寄主形成了内在联系,还可以利用寄主代谢产物为前体,经自身转化成为新成分。内生真菌资源丰富,但至今的研究不够全面,仍存在许多问题待解决。碱蓬(Suaedaglauca)为藜科碱蓬属植物,是一种耐盐的植物,易于在沿海地区或湖边形成单优群落。有研究表明,碱蓬属植物不同时期抗氧化活性与其总黄酮类物质含量相关,但其内生真菌代谢产物的抗氧化活性和抑菌活性鲜有报道。在本研究中,利用平板划线法从健康、无病虫害的碱蓬中筛选的一株曲霉(Aspergillus TQ67),经扩大培养后,首先用乙酸乙酯萃取得到粗提物,随后利用制备反相柱(甲醇和水),从中得到含量最大的组分(化合物)。利用TLC判断不同溶剂的配比。利用HPLC-MS、NMR和2D-NMR鉴别出新化合物。这些经鉴定的8个化合物包括:aspermutarubrol(1)、Sydowiols D(2)、sydowiol E(3)、L-tenuazonic acid(4)、(E)-5-(hydroxymethyl)-2-(6'-methylhept-2'-en-2'-yl)phenol(5)、sydonol(6)、(7S)-(+)-7-O-methylsydonol(7)和 hydroxyl-sydonic acid(8)。同时对这些化合物的抗氧化性(DPPH)进行了测定,其中化合物2、3和化合物1DPPH的IC50分别为(9.79±0.33)和(32.30±1.02)μg·mL-1,表明其具有较好的抗氧化活性。一般认为,海洋植物和藻类随着时间的推移,进化出各种机制,使它们能够抵抗生物和非生物胁迫,以维持它们正常的生理功能。随着分子生物学和生物化学技术的进步,有发现次生代谢产物在海洋植物和藻类适应环境的过程中起着重要的作用。已经证实许多化合物是非生物和生物因素下合成的应激产物,这些因素包括病原体攻击、高重金属浓度、干旱、盐度、创伤,辐射或高可见光强度,以及其他关注度较低的因素。一些研究表明,不同的有机溶剂不仅能刺激海洋植物和藻类的次级代谢产物的产生,而且为发现新化合物提供可能。在本研究中,采用乙酸乙酯和正丁醇对海洋植物旋花滨(Calystegiasoldanella)浸提。首先用乙酸乙酯和石油醚将乙酸乙酯相浸膏用正相柱洗脱,然后用甲醇(甲醇和水)反相柱,从中得到含量最大的组分(化合物)。利用TLC判断不同溶剂的配比。利用HPLC-MS、NMR和2D-NMR鉴别出新化合物。这些经鉴定的化合物包括10个已知的化合物:(+)-Eudesmin(1)、Sesaminol(2)、Sesamin(3)、1,2-Benzenediol、3-methoxy-5-[(lRR,3aS,4R,6aS)-tetrahydro-4-(7-methoxy-1,3-benzodioxol-5-yl)-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl-(4)、Pinoresinol(5)、pluviatilol(6)、9-hydroxy-10,12,15-octadecatrienoicAcid Methyl Ester(7)、sesamin-2,2'-diol Compound(8)、Isoflucosteriol(9)、2'-Methoxy-4”-Hydroxymethoxykobusin(10)。同时对化合物10进行了 2D-NMR分析。与化合物2’-methoxykobusin相比,化合物10缺少1个甲基,同时确定了羟基的位置。利用乙酸乙酯从蓬蘽(Rubushirutus thunb)中分离得到1种已知化合物(ergosterol)。从正丁醇相浸膏中分离得到 2 个已知化合物(3-phenylpropionic acid,(+)-5'-Methoxyisolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside)。由于海洋环境中仍有大量值得关注的化合物,它们仍然是未被开发的药物宝库,并且在今后的一段时间里被开发利用为新颖药物。由于海洋绿藻能够产生大量的次级代谢产物,因此研究人员已经把新的关注点放在了海洋绿藻上。许多新的生物技术和工艺不仅需要用在大规模获取海洋植物和藻类的次级代谢产物,而且还可以用以发现新天然抗生素。适用于海洋生物的生物培养技术和分离纯化方法,其经验方法主要来源于陆地生物,但也反映了海洋生物栖息地的具体需求。目前随着代谢工程和海洋微生物技术的发展,已经使其转化为实验中的一系列步骤,这也是改进次级代谢产物生物合成过程和建立新方法的最佳选择。本文从海洋植物和藻类的海洋抗生素生物合成技术工作中,指出生物技术在抗生素发现到开发各个阶段的发挥巨大的潜力。同时,论文还揭示了海洋植物和海洋藻类抗生素以及其营养和药物产品的可持续创新生产,需要在生物技术和方法开发上投入更多。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914
【文章目录】：
Acknowledgement
摘要
Abstract
List of Abbreviations
CHAPTER 1: Natural Products from Green algae Chlorophyta and Blue Algae Cyanobacteria A mini review
    1.1 Introduction
    1.2 Green algae, a source of bioactive secondary metabolites
    1.3 Alkaloids from green algae
        1.3.1 Bisindole alkaloids
        1.3.2 Other alkaloids and Prenylated compounds
    1.4 Terpenes from Green algae
        1.4.1 Sesquiterpenes
        1.4.2 Diterpenoids
    1.5 Steroids and fatty acid
    1.6 Glycerol and lipids
    1.7 Natural Products from Cyanobacteria
CHAPTER 2: Bioactive Natural Products from Green Algae
    2.1 Introduction
    2.2 Experimental technique
        2.2.1 Algae accumulation
            2.2.1.2 Extraction and isolation of green algae Cladophora stempsonii
            2.2.1.3 First step of extraction
            2.2.1.4 Second step of extraction
            2.2.1.5 Third step of extraction
    2.3 Results and discussion
        2.3.1 Identification and Structure Elucidation of green algae Compounds
            2.3.1.1 Structures determination
        2.3.2 Anti-bacterial activity of green algae compounds
CHAPTER 3: Antioxdant Activities of Compounds from Suaeda Endophytic Fungus and Calystegiasoldanella
    3.1 Equipment's materials
        3.1.1 Equipment
    3.2 Experimental Methods
        3.2.1 Plant Collection
        3.2.2 Extraction and isolation of Plant Calystegia soldanella
        3.2.3 First Step of Extraction
        3.2.4 Second Step of Extraction
        3.2.5 Third Step of Extraction
    3.3 Results and Discussion
        3.3.1 Identification and Structure Elucidation of Compounds
            3.3.1.1 Structures Determination
        3.3.2 Anti-oxidatant Assay
            3.3.2.1 DPPH Radical Scavenging Method
            3.3.2.2 Ferric Reducing Antioxidant Power （FRAP） Assay
        3.3.3 Antioxdant Activities of Compounds from Suaeda Endophytic Fungus
    3.4 Summary
CHAPTER 4: Isolation of Natural Products from Rubus Hirsutus Thunb
    4.1 Introduction
    4.2 Material and Method
        4.2.1 Plant Accumulation
        4.2.2 Extraction and Isolation Process of Plant Rubus Hirsutus Thunb
            4.2.2.1 Extraction with Ethyl-acetate
            4.2.2.2 Extraction with n-butanol
    4.3 Results and Discussion
        4.3.1 Elucidation of isolated compounds and their structure determination
            4.3.1.1 Structure determination
CHAPTER 5: Summary and Conclusion
References
Supplementary material
个人简介

【参考文献】

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1 程战立;时岩鹏;种小桃;姚庆强;;藏紫菀化学成分的研究(Ⅱ)[J];中草药;2011年01期

2 徐剑锟;张天龙;易国卿;许颖;吴红华;裴月湖;;半夏化学成分的分离与鉴定[J];沈阳药科大学学报;2010年06期

本文编号：2890592