shMDR1与吉非替尼共载壳聚糖纳米粒克服肿瘤耐药的研究

发布时间：2020-11-19 17:35

　　 目的宫颈癌(Cervical cancer)是目前国内妇科最常见的恶性肿瘤,严重影响了女性健康。它具有较强转移性和预后复发率高等特点。目前临床上多采取药物治疗作为保守疗法,但随着治疗周期延长,极易产生耐药性。因此,找出抑制耐药恢复药物敏感性的方法,从而对病情有效控制显得尤为重要。宫颈癌细胞表面的P-糖蛋白(P-gp)表达水平远高于正常细胞,且体内P-gp含量高的宫颈癌患者更容易产生耐药。这表明减少P-糖蛋白的过度表达可能成为克服宫颈癌耐药的关键。MDR1是P-gp的编码基因,因此靶向静默MDR1将有效减少P-gp表达。吉非替尼(Gefitinib),是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制剂,在临床上曾经用于治疗非小细胞癌,随着对其性质和药理机制的深入研究,现在吉非替尼也被广泛应用于宫颈癌的治疗,但是耐药现象的产生严重限制了吉非替尼的抗肿瘤作用。因此本课题拟利用小干扰RNA即shMDR1对耐药基因进行静默,减少P-gp的表达,抑制耐药的发生,使耐吉非替尼宫颈癌Hela细胞株重新获得对吉非替尼的敏感性。本研究设计并制备壳聚糖纳米粒将原料药吉非替尼与shMDR1基因共同包裹于纳米粒中,实现基因和抗肿瘤药物的共传递。考察共载纳米粒的稳定性及表征,分析共载纳米粒对吉非替尼耐药细胞株的增殖、凋亡作用影响,初步探究细胞对shMDR1和吉非替尼共载纳米粒摄取机制。证明壳聚糖包载吉非替尼与shMDR1将具有克服肿瘤耐药的潜质,增加化疗效果。方法本实验首先利用紫外吸收光度法建立吉非替尼的含量测定方法,并对方法的线性、重复性、稳定性和回收率等进行考察。采用离子交联法将吉非替尼与shMDR1共包载于材料壳聚糖中,制备成壳聚糖纳米粒。对制备的共载纳米粒进行表征分析,包括外观、形态、粒径,同时对纳米粒的体外释放度及长期稳定性进行考察。通过凝胶阻滞、血清保护实验和酶解实验考察壳聚糖对所包裹质粒shMDR1的保护作用。激光共聚焦显微镜观察shMDR1与吉非替尼共载纳米粒在细胞内的分布情况。通过摄取实验分析细胞摄取共载纳米粒方式。对共载纳米粒的体外抗肿瘤活性进行考察。运用MTT法初步探究shMDR1与吉非替尼共载纳米粒对宫颈癌细胞增殖作用影响。流式细胞术分析shMDR1与吉非替尼共载纳米粒对细胞凋亡影响。Western blot实验检测共载纳米粒对细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达情况。结果建立的吉非替尼原料药shMDR1含量测定方法线性、精密度、重复性、稳定性和回收率均符合方法学要求,故测定方法可用于吉非替尼与shMDR1的体外含量测定。筛选出制备shMDR1与吉非替尼共载纳米粒的最佳处方,所制备的纳米粒大小均匀,透射电镜观察纳米粒的形态呈紧致球形,分散性良好。包封率结果显示所选择的处方能够很好的将两者包封于纳米粒中。吉非替尼包封率为89.8%±7.1%,shMDR1为88.3%±7.2%。共载壳聚糖纳米粒的释放呈现pH依赖性,在pH为5.8条件下吉非替尼迅速释放,但在pH为7.4条件下释放缓慢,shMDR1在纳米粒中的释放行为与吉非替尼相比没有显著差异,在48 h时shMDR1在两种pH条件下的累计释放率均约为75%,体现两者均能从纳米粒中很好的释放到缓冲液。激光共聚焦显微镜观察到共载壳聚糖纳米粒能够富集到细胞核周围,且富集行为呈时间和剂量依赖性。摄取实验能够证明细胞对共载纳米粒的摄取与网格蛋白介导作用相关,通过加入多种抑制剂初步揭示纳米粒在细胞内的转运呈能量依赖性。MTT与流式结果分析显示shMDR1与吉非替尼共载纳米粒能够抑制宫颈癌细胞增殖,具有较强的细胞毒性,能够诱导细胞显著增加凋亡。Western blot实验结果表明共载壳聚糖纳米粒能显著增加细胞Cleaved caspase-3的表达,同时递送的shMDR1能够减少MDR1的含量,证明共载纳米粒能够逆转MDR1介导的耐药机制。结论本研究成功制备了共载shMDR1与吉非替尼的壳聚糖纳米粒,所制备的共载纳米粒具有大小均匀,形态呈球形,分散性良好,呈pH依赖性释放的特点。壳聚糖作为本文的纳米载体能够有效保护质粒与药物在血清、酶存在环境下避免被降解。共载纳米粒对耐吉非替尼的Hela细胞有明显的抑制增殖作用,其机制是shMDR1进入细胞后,阻断耐药基因MDR1的表达,导致P-gp表达减少,逆转耐药,使耐药细胞株Hela恢复对吉非替尼的敏感性,这将有利于在不远的未来,纳米技术应用于基因工程发挥更大的作用,创造更多的价值。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

吉非替尼紫外可见光谱扫描图

图 1B 壳聚糖紫外可见光谱扫描图非替尼标准曲线的绘制 结果所示，X 轴是吉非替尼标准品浓度 C，Y 轴是吸光度绘制成标准曲线，得到回归方程 A=0.0212C+0.023，相

可以排除其对吉非替尼含量测定的干扰。图 1A 吉非替尼紫外可见光谱扫描图图 1B 壳聚糖紫外可见光谱扫描图2、吉非替尼标准曲线的绘制如图 2 结果所示，X 轴是吉非替尼标准品浓度 C，Y 轴是吸光度 A，根据所得检测结果绘制成标准曲线，得到回归方程 A=0.0212C+0.023，相关系数 r＝0.9991，说明吉非替尼质量浓度在 1～50 μg/mL 内线性关系良好。
【参考文献】

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本文编号：2890269