肝素前体heparosan的化学酶法修饰及体外抗黏附作用初步研究

发布时间：2020-11-21 18:28

　　 肝素(heparin,HP)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)与葡萄糖胺(glucosamine,GlcN)构成的二糖单元组成的一种糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),其中二糖单元的不同位点存在不同程度的硫酸化修饰,导致肝素结构十分复杂。肝素是临床上重要的抗凝药物,临床实践还发现肝素能明显延长癌症患者的生存期,药理活性研究进一步证明肝素及其衍生物在动物体内具有显著的抗肿瘤转移作用,其主要机制是阻断肿瘤细胞黏附、抑制新生血管生成等。但动物源肝素存在较大的安全隐患,而且化学法脱硫酸化、乙酰化修饰可能导致肝素衍生物的工艺可靠性差、结构更为复杂。因此,迫切需要发展一种更加安全、可靠的制备肝素及其衍生物的新方法。大肠杆菌K5(Escherichia coli K5)产生的荚膜多糖是一种非硫酸化的GAG,二糖重复单元由GlcA与乙酰葡萄糖胺(acetyl glucosamine,GlcNAc)组成,因而被称为肝素前体(heparosan或N-acetylheparosan,NAH)。本课题通过发酵大肠杆菌K5制备肝素前体heparosan;然后采用化学处理与酶催化反应相结合的策略对其进行选择性修饰,以合成不同硫酸化修饰模式的肝素衍生物;最后测定得到的五种肝素衍生物体外对肿瘤细胞黏附人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影响,揭示肝素衍生物抑制肿瘤细胞黏附的构效关系,为研究非动物源抗肿瘤肝素类创新药物提供参考依据。本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:1.Heparosan多糖的制备与表征大肠杆菌K5在葡萄糖合成培养基中摇瓶发酵18 h,发酵上清液经超滤浓缩、醇沉得胞外多糖粗品,粗品经强阴离子交换柱层析纯化得多糖精品,以每升发酵液制备的多糖纯品计,产量为105 mg/L。双糖分析与核磁共振(NMR)测试表明制备的细菌胞外多糖的结构与肝素前体heparosan相同;凝胶渗透色谱(GPC)分析表明heparosan的纯度为98.2%,分子量为69.22 kDa,制备规模达到克级。2.非动物源肝素衍生物的制备与结构表征Heparosan在碱性条件下彻底N-脱乙酰化,其后以三氧化硫-三甲胺复合物为硫酸基供体进行N-硫酸化(NS)修饰得到含N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的肝素衍生物(命名为NS-NAH),其肝素酶完全水解产物的双糖分析确定不饱和双糖△U-GlcNS的比例为97.9%,说明绝大多数GlcNAc被修饰为GlcNS。在C5异构化酶(Cs-epi)和2-O-硫酸基转移酶(2-OST)的共同催化下,NS-NAH的GlcA残基一步转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),经QSepharose强阴离子交换柱层析纯化得到含IdoA2S的肝素衍生物(命名为I2S-NS-NAH),双糖分析证明其双糖△U2S-GlcNAc、AU2S-GlcNS 的含量 0.7%、90.4%,表明 GlcA 的转化率超过90%。在6-O硫酸基转移酶1和6-O硫酸基转移酶3(6-OST1/3)的催化下,I2S-NS-NAH 的 GlcN(GlcNS 及 GlcNAc)残基被 6-O-硫酸化(6S),离子交换柱层析纯化得到含GlcNS6S、GlcNAc6S的肝素衍生物(命名为6S-12S-NS-NAH),双糖分析表明其双糖 △U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S 和AU2S-GlcNS6S 的含量为 0.5%、13.5%、66.4%,表明 GlcN 的 6S 修饰率80%。NS-NAH经6-OST1/3两酶的催化修饰、离子交换柱层析纯化得到另一种6S修饰的肝素衍生物(命名为6S-NS-NAH),双糖分析确定其双糖△U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S含量为0.4%、87.4%,表明GlcN的6S修饰率达87.8%。此外,将6S-I-2S-NS-NAH 溶于 0.5M NaOH 并于-20℃静置 3d、冻干使 IdoA2S 发生 2-0-脱硫酸化,得到含IdoA的产物(命名为6S-I-NS-NAH),双糖分析表明90.5%的IdoA2S发生2-0-脱硫酸化。NMR鉴定了五种肝素衍生物的结构特征;GPC纯度分析表明除6S-I-NS-NAH外,其余四种肝素衍生物的纯度均达90%;衍生物的制备规模均达到百毫克级。3.肝素衍生物的抗凝活性及对肿瘤细胞黏附的影响运用抗FXa试剂盒测定heparosan及五种肝素衍生物的抗凝活性。实验证实全部样品的效价均不到对照品肝素钠的1%,因此合成的产物为非抗凝肝素衍生物。参考文献从新生儿脐带中提取HUVECs并采用流式细胞技术进行鉴定。细胞毒性测定结果表明,浓度2000μg/ml的heparosan及五种肝素衍生物对HUVECs与肿瘤细胞均无明显的细胞毒性(P0.05)。浓度为200μg/ml的五种肝素衍生物均对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10展现出一定的细胞毒性(P0.05),而heparosan则不能;对于人乳腺癌细胞MDA-MB-231,只有6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH展现出细胞毒性(P0.05);而对HUVECs,只有I2S-NS-NAH表现出一定细胞毒性(P0.05)。肿瘤细胞黏附HUVECs实验证实,在测试的低、中、高三个浓度下(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml),heparosan和NS-NAH均没有表现出明显的抗黏附作用;12S-NS-NAH在高浓度下能抑制B16-F10黏附HUVECs作用,而中、高浓度的6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH、6S-NS-NAH均展现出抗黏附作用,对照品肝素钠在低中高浓度下均展现出抗黏附作用。中浓度的6S-12S-NS-NAH具有明显的抗黏附作用(P0.05),I2S-NS-NAH 则没有(P0.05);6S-NS-NAH 在中、高浓度下均具明显的抗黏附作用(P0.05),而NS-NAH均无作用(P0.05),因此,6-O-硫酸化对肝素衍生物的抗黏附作用是非常关键的。不同浓度的6S-I2S-NS-NAH与6S-I-NS-NAH相比,抗黏附作用没有显著差异(P0.05),提示IdoA的2-O-硫酸化对抗黏附作用没有显著影响。此外,6S-NS-NAH与6S-I-NS-NAH的抗黏附作用也没有显著差异(P0.05),二者主要区别在于糖醛酸的不同,说明GlcA与IdoA对肝素衍生物的抗黏附作用影响不大。与其他衍生物比较,以heparosan为原料合成肝素衍生物6S-NS-NAH的工艺简单、产率高,值得进一步研究和开发。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914;R96
【部分图文】：

而后再培养１８－２４ｈ，发酵液离心并收集菌体沉淀，菌体于冰上超声破碎，??离心，上清液过滤后用ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱层析（１．５ｃｍ＞＜１５ｃｍ）进行纯化，??上样后先用Ａ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣｌ、３０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）充分洗脱以??除去杂蛋白，然后再用Ｂ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣＩ、２５０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）??洗脱目的蛋白，向目的蛋白溶液中加入１５％－２０％的甘油，－８０°Ｃ冻存备用。??３．结果与分析??３．?１?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的提取与纯化??发酵液经醇沉得到的ｈｅｐａｒｏｓａｎ含有蛋白质、色素、盐等杂质，为一种粗品。??运用Ｑ?Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ强阴离子交换柱纯化可将ｈｅｐａｒｏｓａｎ与杂质分离，如图２－１，中??间只有２１０?ｎｍ吸收而没有２６０?ｎｍ和２８０?ｎｍ吸收的峰即为ｈｅｐａｒｏｓａｎ的纯化峰。??经计算，以纯化后冻干的ｈｅｐａｒｏｓａｎ纯品计，每升发酵液产量约为１０５?ｍｇ。??３３Ｋ，??３３００－?＊??

３．?２?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的表征??Ｈｅｐａｒｏｓａｎ经肝素酶ｍ切割后进行ＨＰＬＣ分析，与肝素双糖标准品的ＨＰＬＣ??图谱（如图２－２）比较，ｈｅｐａｒｏｓａｎ多糖全部被切成双糖ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ?（如图２－３），??这表明ｈｅｐａｒｏｓａｎ的双糖重复单元为－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃ－。同时由Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的１Ｈ?ＮＭＲ??图谱可清楚看到ＧｌｃＮＡｃ的异头氢（５５．２９）、Ｎ－乙酰基的氢信号峰（Ｓ１．９４）和??ＧｌｃＡ的异头氢（５４．４０），如图２－４。因此，发酵纯化后制备的ｈｅｐａｒｏｓａｎ结构特??征与文献报道的结构相符。ＧＰＣ分析结果显示，１４．７?ｍｉｎ处出现单一对称峰，如??图２－５，因此经醇沉与强阴离子交换柱层析纯化后的ｈｅｐａｒｏｓａｎ纯度达９８．１９％。??以多角度激光散射（ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，?ＭＡＬＬＳ）测定?ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的??重均分子量为６９．２２?ｋＤａ，多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ?ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）?１．５６，如图??２－６?〇??０．０６－｜?６??Ｅ?３?５?８?１?ＡＵ－ＧＩｃＮＡｃ??１２?２?ＡＵ－ＧＩｃＮＳ??Ｃｇ?０．０４－?４?３?ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ??苑?

图２－６?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的多角度激光散射图谱（见实验记录本ＩＩＩ－ｐｌｌ）??Ｆｉｇ．２－６?Ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ｈｅｐａｒｏｓａｎ??４讨论??大肠杆菌Ｋ５经摇瓶发酵，两步纯化得到ｈｅｐａｒｏｓａｎ，产量约１０５?ｍｇ／Ｌ，但??与文献报道产量还有一定差距［２９］。通过进一步优化发酵条件和纯化步骤，尤其运??３０??
【参考文献】

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本文编号：2893417