研究背景:随着医学的发展,药物治疗已成为医疗活动中最重要的、最常见的手段,每年有数以千万的儿童在接受药物治疗。药物治疗给患病儿童带来福音,保护他们的健康,提高他们的生命质量;同时也带来一些不良反应,尤其是神经系统方面的副作用;严重的神经毒性反应常常使病人面临降低药物剂量甚至停药的困境,同时对病人的心理、生理、和生活质量都可能产生损害。在过去几十年里,科学家们为了探究药物副作用对中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的毒性机制,进行了大量的研究,但是进展非常缓慢。因此,研究药物神经毒性的作用机制,已是迫在眉睫的任务。利血平(Reserpine)在临床上被广泛使用于高血压与精神分裂症的治疗;其主要药理作用机制是通过限制特异性单胺囊泡转运体(Monoamine vesicle transporter VMAT)阻碍神经递质进入囊泡造成突触末端多巴胺等神经递质的消耗。临床观察和研究发现利血平存在导致抑郁样和帕金森样症状的副作用。已有研究表明高浓度利血平对实验动物CNS产生影响,包括在行为上运动减缓以及相关神经递质水平的降低;利血平可以抑制多巴胺能神经元的生长和发育,减少大鼠黑质致密部酪氨酸轻化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)细胞的数量。在CNS内,多巴胺能神经元分布于端脑、间脑、脑干和脊髓,形成四个主要的投射通路,行使不同的功能。TH作为催化儿茶酚胺生物合成的限速酶,被广泛使用于多巴胺系统表达的标记物。有研究表明调节细胞增殖与分化的糖蛋白Wnt家族在多巴胺能神经元发育中会出现差异性表达。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(Midbrain astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在保护多巴胺能神经元系统抵御神经毒性损害中发挥着重要作用。此外,Otpa与Otpb则是与多巴胺能神经元发育相关。微小RNA5(microRNAs,miRs)是一类高度保守性、非编码RNA,通过与内源mRNA碱基配对抑制靶基因的表达来实现其生物学功能。数以百计的miRs在哺乳动物的大脑中表达,并参与到各种各样的功能中。miRs与神经退化和精神疾病的病因学和病理生理学均密切有关。miRs对CNS的正常发育和生理活动以及药物的神经毒性均具有重要的调节作用。miRs的固有特点使其成为调控神经元应激的关键环节之一。不同疾病的miRs表达模式不同说明不同致病机制导致的神经元损害可以表现在特异性的miRs变化上。miRs几乎在调节所有细胞过程中发挥积极作用。探索潜在的miRs靶基因,临床应用可能会取得更大进展。miR-129存在于小鼠、人类、大鼠、斑马鱼等物种体内。miR-129是通过miR-129-1和miR-129-2这两种基因转录而生成,miR-129家族由miR-129-1和miR-129-2组成;miR-129-1-3p和miR-129-2-3p两者之间只有一个碱基差异,几乎不可能从功能上区别,统称为miR-129-3p。利用miRBase数据库查阅不同物种miR-129的序列,发现miR-129在不同物种中具有高度保守性,有研究表明miR-129调控一系列与癌症的诊断和治疗以及其它生理过程密切相关的基因,由此可见mtiR-129参与调控各项重要的生理活动。已有研究证实miR-129-3p在斑马鱼胚胎的脑部大量表达。据此我们推测miR-129-3p在斑马鱼大脑神经系统中扮演着某种重要的角色。然而,miR-129-3p对认知功能的影响及调节机制有待进一步研究。斑马鱼体型纤细,繁殖能力很强,养殖成本低。更重要的是,斑马鱼基因组与人类基因组相似度达87%,这意味着在其身上做实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体。斑马鱼是拥有脊椎动物保守的神经系统构造和丰富的行为模式,幼龄斑马鱼其脑部透明、结构简单,成为探究神经系统发育和药物神经毒性发病机制的理想模型。因此本研究选择斑马鱼作为实验模型,探讨胚胎期利血平暴露对胚胎期神经系统发育的影响及可能的分子机制。rcan2是一种甲状腺激素的应答基因,也是钙依赖磷酸酶的调控基因。rcan2在小鼠大脑内特异性高表达,此外在心肌和骨骼肌中也有分布。rcan2蛋白与唐氏综合症、心脏肥大症和阿尔兹海默症等疾病病理学相关。rcan2蛋白主要通过结合并运输Ca2+和丝氨酸-苏氨酸磷酸酶来行使功能。活化T细胞核因子是它的底物,可介导一系列重要信号通路的调控,包括神经元发育。有研究表明rcan2的敲除降低了小鼠的进食量,导致小鼠体重的减轻、脂肪含量的减少和运动量的轻微减弱。经过Targetscan数据库的比对,发现miR-129-3p与rcan2基因拥有潜在的结合位点,推测miR-129-3p可能调控rcan2的表达。为了明确利血平神经毒性作用,miR-129-3p对斑马鱼胚胎CNS的影响,以及与rcan2的相关性。本研究设计两部分实验来进行:(1)利血平在斑马鱼胚胎中的神经毒性研究;(2)miR-129-3p通过rcan2拮抗利血平诱导的斑马鱼神经毒性研究。第一部分利血平在斑马鱼胚胎中的神经毒性研究目的:通过对利血平处理后斑马鱼胚胎的研究,探究其对斑马鱼早期神经系统发育的毒性作用。方法:行为学监测利血平处理后斑马鱼胚胎运动功能变化,以及利血平处理后斑马鱼胚胎对光与声音刺激的敏感性改变;液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatography-mass spectrometer LC-MS)技术检测利血平处理后斑马鱼胚胎多巴胺能神经元相关的各神经递质水平的变化;qRT-PCR检测利血平处理后对斑马鱼胚胎多巴胺能神经元系统发育相关基因表达情况的影响;原位杂交技术检测利血平处理后斑马鱼胚胎大脑视叶前区多巴胺能神经元数量改变情况。结果:不同浓度利血平处理后斑马鱼胚胎在光照或黑暗情况下均出现平均游动距离显著性降低,平均游行速度明显减缓;利血平处理后斑马鱼胚胎对外界光或声音刺激敏感性下降,平均游动距离降低,平均游行速度减缓,刺激出现时反应减弱;并且发现斑马鱼胚胎中单胺类神经递质含量水平,包括多巴胺,5-轻色胺与去甲肾上腺素,在经过利血平浸泡的斑马鱼胚胎中较对照组明显下降,而5-羟色胺代谢产物含量没有发生明显变化。同时,利血平处理后的斑马鱼胚胎大脑中视叶前区多巴胺能神经元数量较对照组减少。而与多巴胺能神经元系统发育相关的基因,包括otpa,otpb,wnt1,wnt3,wnt5和manf在利血平处理组中均表现表达下调。结论:利血平药物对斑马鱼早期神经系统会产生神经毒性作用,对其发育和功能产生影响,包括运动功能受损、对外界刺激敏感性降低、单胺类神经递质含量减少;斑马鱼大脑中多巴胺能神经元出现损伤以及相关基因表达下调。本实验成功建立斑马鱼帕金森样模型,为今后药物对中枢神经毒性的研究,做出很好的尝试,并打下良好基础。第二部分miR-129-3p通过rcan2拮抗利血平诱导的斑马鱼神经毒性研究。目的:通过对miR-129-3p在斑马鱼体内功能的研究,探究其对斑马鱼胚胎机体和早期神经系统发育的调控作用,以及miR-129-3p介导的rcan2拮抗利血平的神经毒性研究。方法:qRT-PCR检测miR-129-3p在斑马鱼胚胎和成鱼体内的表达谱;显微注射miR-129-3p类似物和morpholino以高表达和敲降斑马鱼胚胎体内miR-129-3p的表达水平;免疫荧光法检测高表达或敲降miR-129-3p后对斑马鱼胚胎头部细胞增殖和细胞凋亡的影响;原位杂交检测敲降miR-129-3p后斑马鱼胚胎大脑内视叶前区多巴胺能神经元数量改变情况;行为学检测利血平处理显微注射miR-129-3p类似物的斑马鱼胚胎运动功能变化;qRT-PCR检测利血平处理后斑马鱼胚胎miR-129-3p表达情况;原位杂交技术检测利血平处理显微注射miR-129-3p类似物后斑马鱼胚胎大脑内视叶前区多巴胺能神经元数量改变情况;qRT-PCR检测高表达或敲降miR-129-3p后对rcan2表达情况的影响。结果:随着斑马鱼胚胎的发育,miR-129-3p的表达水平随之升高;miR-129-3p在成年斑马鱼的脑部大量表达;高浓度miR-129-3p的敲降会造成斑马鱼胚胎发育畸形,而miR-129-3p的高表达则会导致斑马鱼胚胎行为学发生变化;miR-129-3p的敲降会引起斑马鱼胚胎细胞凋亡的增加;敲降miR-129-3p的斑马鱼胚胎大脑中视叶前区多巴胺能神经元数量较对照组减少,而高表达miR-129-3p可部分挽救由利血平造成的斑马鱼行为减缓以及大脑中视叶前区多巴胺能神经元数量的减少。利血平处理后导致斑马鱼胚胎miR-129-3p水平下调。此外,miR-129-3p的敲降还导致了r an2的表达水平上升,而miR-129-3p高表达则引起了rcan2表达水平的下降。结论:miR-129-3p对斑马鱼的胚胎机体和神经系统的发育至关重要。miR-129-3p的降低会造成斑马鱼大脑中多巴胺能神经元受损。利血平处理后斑马鱼miR-129-3p水平降低。miR-129-3p的高表达可挽救由利血平暴露引起的多巴胺能神经元系统发育功能损伤。rcan2是miR-129-3p调控的一种潜在的靶基因。本实验为研究药物神经毒性的发生机制和防治措施提供新的思路。两部分整体结论:使用利血平药物将导致斑马鱼大脑中多巴胺能神经元的损伤;miR-129-3p对斑马鱼的胚胎机体和神经系统的发育至关重要;miR-129-3p的降低会造成斑马鱼大脑中多巴胺能神经元受损;利血平导致斑马鱼胚胎miR-129-3p水平降低。高表达miR-129-3p对利血平诱导的斑马鱼胚胎神经系统损害具有保护作用;rcan2可能是miR-129-3p调控的一个潜在的靶基因。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R965
【部分图文】：
ＲＩＳＣ）的一部分，它通过与靶ｍＲＮＡ?３ＴＪＴＲ完全或不完全的互补堪合，导致靶??ｍＲＮＡ的降解或翻译的抑制，通过表观遗传学调控ＤＮＡ甲基化与组蛋白修饰，??从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡（图１－１）?（３０－３２）。一个??ｍｉＲ可以耙向多个ｍＲＮＡ，相反，一个ｍＲＮＡ可以被多个ｍｉＲｓ耙向。ｍｉＲｓ??几乎在调节所有细胞过程发挥积极作用，包括分化、上皮间质转化??（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）、增殖、凋亡、迁移和血管生成等。探??索潜在的ｍｉＲｓ祀基因，临床应用可能会取得更大进展。ｍｉＲｓ可以对其目标基因??的表达进行微调，超过２５００个ｍｉＲｓ被标注在人类基因组中，超过６０％的人类??蛋白质基因被预测为ｍｉＲｓ的靶点。??１７??
调控各项重荽的生理活动。ｍｉＲ－１２９拥有其特定的组织特异性表达模式，主要在??生物体的脑部表达，已有研宄者证实其在斑马鱼胚胎的脑部和原肾中大量表达??（
图５?ｍｉＲ－１２９－３ｐ高表达后斑马鱼胚胎（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）行Ｆｉｇ．５?Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｚｅｂｒａ?ｆｉｓｈ?ｅｍｂｒｙｏ（７２ｈｐｆ－９６ｈｐｆ）?ａｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｍｉＲ－１２９－３ｐ??２４ｈｆ４８ｈｆ７２ｈｆ??
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