超高灵敏流式检测技术在单颗粒水平纳米尺度蛋白质团聚体检测中的应用

发布时间：2020-11-21 13:16

　　 蛋白质药物是生物制药的重要组成部分,主要包括激素、蛋白酶、生长因子、细胞因子、单克隆抗体、重组抗体和蛋白疫苗等。与传统的小分子化学药物相比,蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒副作用低等优势,目前广泛应用于恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病、细菌和病毒感染等重大疾病的治疗中。据统计,目前全球蛋白质药物市场的规模已经超过1400亿美元,并持续稳定增张。因此,蛋白质药物的发展对人类健康和社会经济的发展均具有重大意义。但是蛋白质药物也存在缺陷,尤其是其稳定性远低于小分子化学药物。在生产、纯化、运输和储存等过程中,蛋白质药物容易因环境刺激或自身稳定性因素而发生表面残基氧化、二硫键断裂、肽链解折叠和构象改变等变化,而这些变化最终都可能导致蛋白质团聚。蛋白质团聚体的形成会降低蛋白质药物的治疗效果。更为严重的是,蛋白质团聚体若随药物通过静脉注射进入患者体内会诱发免疫反应,甚至引起过敏性休克,严重则危及患者生命。所以,对蛋白质药物中的蛋白质团聚体进行检测和研究极为重要。近40年来,伴随蛋白质团聚体检测技术和方法的不断发展,蛋白质团聚机制的研究、提高蛋白质稳定性的化学修饰和分子生物学改造、蛋白质团聚抑制剂的探索和蛋白质药物质控标准的完善等都得到了极大的促进和发展。根据文献中电子显微镜的检测结果:蛋白质团聚体的粒径主要分布在20～300nm之间。因此,建立纳米尺度蛋白质团聚体的检测方法对蛋白质药物质控、团聚机理研究等至关重要。本论文将利用我们实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置(High-Sensitivity Flow Cytometer,HSFCM)在侧向散射检测的高灵敏性和媲美电镜的高分辨率,建立纳米尺度的单颗粒水平蛋白质团聚体检测方法,为蛋白质药物的团聚研究和质量控制提供先进、快速的检测平台。我们首先选取牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)为蛋白质模型,通过加热刺激形成蛋白质团聚体并进行检测,发现HSFCM能够有效检测到纳米尺度的蛋白质团聚体,并证明蛋白质团聚体主要分布在纳米尺度,且团聚体的大小基本上都位于HSFCM的侧向散射检测范围内;在考察了逐级稀释对检测无影响后,我们利用已知浓度和粒径的纳米颗粒标准品,建立一种在单颗粒水平对纳米尺度的蛋白质团聚体浓度和粒径的检测方法。接着,我们对BSA团聚体的制备条件进行优化,以BSA为对象,考察了金属盐、糖、多元醇、氨基酸和环糊精等赋形剂种类和浓度对蛋白质团聚的抑制作用,为研究赋形剂对蛋白质团聚影响提供了一种全新的快速检测、优化和筛选方法。最后我们又将该方法应用于在氧化及还原条件下赋形剂对蛋白质团聚抑制作用的筛选和优化。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R91
【部分图文】：

羰基氧（Ｃ＝０）与其前面第４个氨基酸残基（ｉ＋４）的酰胺质子氢（Ｎ－Ｈ）之间通??过氢键作用形成的封闭１３元环。由于ａ螺旋垂直方向的对齐存在轻微偏移，随??着肽链的延长会造成二次扭转形成（如图１．１ａ所示）。ａ螺旋的主链二面角角度??和空间位阻是最有利于形成的螺旋结构。其它不常见的还有３１（）－螺旋和螺旋等。??Ｐ折叠也是一种常见的蛋白质二级结构（如图１．１ｂ，ｃ所示）。ｐ折叠中的每条肽??链叫Ｐ股，氢键主要是在股间形成。折叠片主要有两种形式，一种是平行式，另??—种是反平行式，这两种折叠片中氢键的形成方式是不同的，其中平行式中形成??的氢键有明显的弯折。纤维状蛋白是典型的二级结构蛋白，具有规则的线性结构，??这与其多肽链的有规则二级结构相关。??连续不断延伸的重复氢键可以稳定蛋白质的每个结构元素，并帮助肽链在局??部区域内形成紧凑的聚合。氢键的形成不但限制可排列肽段末端的数目，而且也??有助于形成更佳的蛋白质三维结构（三级结构）。三级结构包括侧链在三维空间??中彼此间的相互关系和一级结构中相距远的的肽段之间的几何相互关系。由于侧??链由不同的化学基团组成，故侧链之间的相互关系存在吸引力和排斥力。而远端??肽段之间的有利几何相互关系造就了蛋白质三级结构的天然构型

第一章绪论体主要是由平行的和反平行的（３折叠结构组成。其中，典型的由反平行股纤维状蛋白质团聚体多是由短肽链形成的：而相同序列的长肽链则优先地的方式排列形成平行股构成纤维状蛋白质团聚体，这种纤维状蛋白质团聚型结构可以在Ｐ淀粉样蛋白中观察到。绝大多数的纤维状蛋白质团聚体都行股构成的。??＾??

?第一章绪论???尿病中导致Ｂ淋巴细胞死亡的胰淀素，帕金森综合征中的ａ突触核蛋白等１１６１。??此外，对体外非疾病相关蛋白的研究也表明，几乎任何蛋白质都能通过环境Ｗ素??诱导形成团聚或淀粉样斑，因此，团聚是蛋白质普遍存在的一大现象，是一种常??见的蛋白质行为机制｜１７１。用于治疗各种疾病的蛋白质药物会因为形成团聚体而??产生毒副作用，在某些情况下还会导致体内淀粉样斑的形成蛋白质团聚已??经被观察到会在蛋白质药物的纯化和储存过程中发生，而含有蛋白质团聚体的蛋??白质药物在临床治疗使用中己被证明会刺激机体产生免疫反应，造成的影响可以??从轻微的皮肤刺激性到严重的全身性过敏反应等｜｜（）】（如图１．３所示）。同时，蛋??白质团聚也会造成蛋白质药物的疗效降低，甚至失效１２？２３】。正因为如此，人们正??在努力研究如何提高蛋白质药物的稳定性以抵抗蛋白质团聚。理解蛋白质的基本??特性对于蛋白质团聚及其形成机制的研究十分重要。同时，对蛋白质团聚机制的??研究对于决定如何预防和治疗多种蛋白质团聚相关疾病也至关重要。??
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本文编号：2893056