促进少突胶质细胞分化和髓鞘再生药物的筛选及其作用机制研究

发布时间：2020-11-22 04:37

　　 少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的成髓鞘细胞,由少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)分化而来。髓鞘的形成不仅为神经元间高速快捷的电信号传导所必须,还为轴突提供营养支持,保护轴突完整性。OL对多种内外环境的损伤因素敏感,易发生细胞损伤、功能失调甚至凋亡,导致严重的脱髓鞘疾病,甚至精神疾病,如:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)、精神分裂症等。髓鞘损伤的修复依赖于OPC,这些细胞均匀分布于CNS,且维持前体细胞的特征,可在损伤情况下增殖,并分化为成熟OL,修复受损的髓鞘,即髓鞘再生(Remyelination)。但由于细胞微环境中的抑制性信号分子等原因,OPC分化常常受到抑制,而不能完成髓鞘再生。因此,研究促进OPC分化和髓鞘再生对于CNS脱髓鞘疾病的治疗方法有着重要的科学意义。其中,发现能促进OPC分化和髓鞘修复再生的药物或药物靶点也是神经科学基础和临床研究关注的重要科学难题之一。筛选能促进OPC分化的药物或化合物是促进髓鞘再生治疗最直接的方法之一。传统方法利用细胞培养,逐一筛查药物其对OPC分化的影响。该方法的弊端是过程耗时耗力,而且效果也难以同其他药物或化合物相比较,进行优中选优。为了满足对挖掘药物的高效、高质量的要求,有必要建立一种新的筛选方法。最新的高通量筛选技术是筛选并挖掘有效药物及化合物作用及其机制的有效方法。其中,二元指示髓鞘化纳米微柱阵列(Binary Indicant for myelination using Micropillar Arrays,BIMA)技术,可以实现对髓鞘形成药物的大批量筛选。且高通量技术(如RNA微阵列)能为我们提供更多、更完整的关于具体生物过程的基因表达信息,帮助我们更好的理解生物过程背后的作用机制。通过与国外实验室合作,我们成功建立了该筛选体系。本研究中,我们应用BIMA系统筛选了大量药物和化合物。发现非典型性抗精神病药喹硫平(quetiapine,QUE)是其中的一种有力的选药物,能有效促进OPC分化和髓鞘再生。我们进一步以QUE作为工具药,利用微阵列技术检测了QUE作用后,OPC分化的基因表达谱改变及基因本体学变化特点,发现染色质重塑复合体相关基因可能在OPC分化中发挥了重要作用。而近年来研究表明,表观遗传调控,尤其以Brg1为代表的染色质重塑分子在OPC分化中扮演了重要的角色。为此,我们制备了少突胶质细胞系特异性转基因小鼠,对微阵列分析中发现的,可能在OPC分化中发挥关键调节作用的分子,染色质重塑分子BAF155的作用进行了初步的探讨。此外,我们也对BIMA系统筛选发现的广谱药物—阿司匹林是否可促进OPC分化和髓鞘形成,以及其作用机制进行了研究。主要结果如下:(1)利用BIMA系统筛选发现可能促进OPC分化的候选药物利用最新发现的高通量髓鞘形成筛选BIMA系统。我们对药物/化合物库中200种化合物进行筛查,发现了一系列能促进分化OPC分化的药物。通过免疫荧光染色和Western Blot等技术,我们对氯马斯汀、U50488和QUE等几种能显著促进OPC的分化的药物进行了初步的细胞学效应验证。其中我们主要感兴趣的是,本实验室前期研究一直关注的药物,非典型性抗精神药喹硫平QUE。(2)QUE促进OPC分化和髓鞘再生通过免疫荧光染色和Western Blot,我们发现,QUE处理后,不仅能促进培养OPC分化成熟,也显著提高了新生大鼠胼胝体区MBP的表达,促进髓鞘形成。而在Cuprizone脱髓鞘模型中,QUE能有效促进髓鞘再生,表明QUE是有力的候选药物,可作为研究促进OPC分化和髓鞘再生机制及药物靶点的工具药。(3)微阵列筛查发现染色质重塑蛋白BAF155参与OPC分化利用微阵列技术,以QUE为工具药,我们研究了其作用机制。首先通过OPC正常分化过程中微阵列检测出的差异基因,我们明确了该技术能够更全面地反应OPC分化过程中的基因变化和重要的信号通路。通过检测与OPC正常分化相比较,QUE处理后出现显著上调/下调的基因聚类发现,我们发现QUE处理后,染色质重塑复合体相关基因出现明显下调,与其促进OPC分化重要密切相关,通过对相关基因具体分析,我们发现BAF155变化最为显著,可能是调控OPC分化的关键候选分子。(4)BAF155对调控OPC的分化具有重要作用我们设计并制备了BAF155 flox小鼠。通过与PDGFaRCreERT小鼠杂交,成功获得可在少突胶质前体细胞特异性敲除BAF155小鼠(BAF155~(flox/flox),PDGFaRCre+/+)。在发育过程中使用他莫昔芬诱导特异性敲除OPCs中的BAF155。利用免疫荧光和原位杂交等技术检测了BAF155对OPC发育分化的作用,我们的结果表明,在OPC中敲除BAF155后,成熟OL标志物MBP和MAG表达下降,说明BAF155在OPC分化中发挥重要的调节作用,其详细机制还需要进一步研究。(5)发现和鉴定阿司匹林促进OPC分化和髓鞘形成的新作用利用培养的OPC,我们发现:阿司匹林处理后,培养OPC中Ki67和PDGFaR双标染色(即增殖OPC)细胞数没有明显改变,而OL成熟标志物MBP阳性细胞数明显增高,细胞形态上也表现出成熟OL的特性;新生大鼠脑白质发育模型中,阿司匹林处理后MBP表达明显增强,表明阿司匹林可促进OPC分化好髓鞘形成。进一步研究发现,阿司匹林处理后,Wnt/β-catenin信号通路中的重要信号分子,GSK-3表达水平明显升高,其下游靶向因子β-catenin磷酸化水平升高,而GSK3β磷酸化水平下降;用QS11,一种选择性的Wnt/β-catenin信号通路激动剂处理OPC后,OPC分化受到了明显抑制,而阿司匹林处理能拮抗QS11的作用。以上结果表明,阿司匹林可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,促进OPC的分化。综上所述,为了发现促进OPC分化和髓鞘形成的药物靶点,我们利用BIMA系统及微阵列等高通量筛选技术,发现QUE是一种有效促进OPC分化和髓鞘再生的候选药物,并以QUE为工具药,发现了染色质重塑复合体相关分子BAF155在OPC分化中的重要调控作用。同时,我们也发现并阐明了阿司匹林通过抑制Wnt/β-catenin信号传导通路促进OPC分化的作用途径。以上研究为我们进一步挖掘促进OPC分化和髓鞘再生药物的新途径和新靶点提供了新的思路。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

陆军军医大学博士学位论文 个复杂的过程，单纯加少量外来物质（1μM）不足以外，BIMA 筛选出的药物或化合物在增殖和分化的作用进增殖要么促进分化，这个结果符合增殖和分化在生物结果证明了我们建立的 BIMA 高通量筛选体系的有效

24图 2-3 BIMA 检测促进 OPC 分化的代表性药物示意及效果统计。A. BIMA 检测结果免疫荧光扫描图示意（红色荧光标记为 PDGFaR，用于标记 OPC 细胞，绿色荧光标记为 MBP，用于标记成熟 OL）。B. 量化统计免疫荧光扫描图检测结果，数据按平均数（+）标准差形式展示。*与未给予药物处理组对比，p <0.05。

图 2-4 免疫荧光染色验证 BIMA 筛选出的药物效果。A. 培养 OPC，加入 QUE，U50488 或氯马斯汀处理后 6 天时免疫荧光检测结果（红色荧光标记为 PDGFaR，用于标记 OPC 细胞，绿色荧光标记为 MBP，用于标记成熟 OL，以下相同）。B. 量化统计药物处理后阳性 MBP 和 PDGFaR 细胞数，反映了细胞分化情况。数据按平均数（+）标准差形式展示。**与未给予 QUE 组对比，p <0.01。2.3.3 QUE 促进 CNS 髓鞘发育和再生为明确 QUE 是否能促进 CNS 髓鞘发育，我们对新生 3 天大鼠给予 QUE 灌胃处理，于 7 天和 14 天后取材，免疫荧光染色结果表明，QUE 处理后，大脑中胼胝体区 MBP明显增多，Western Blot 结果也反映了相同趋势（图 2-5）。以上结果表明，QUE 能有效促进 OPC 分化和髓鞘形成。考虑到髓鞘再生对药物治疗少突胶质细胞相关疾病的重要性，我们检测了 QUE 在髓鞘再生中的作用。首先，我们按之前本实验室方法建立了经典的 Cuprizone 脱髓鞘模型，喂食 Cuprizone 6 周后中止，结束脱髓鞘的同时，给予 QUE（10mg/kg/天）处理。治疗 2 周后，用免疫组化的方法检测胼胝体区 MBP 表达，结果表明，相比对照组，QUE
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本文编号：2894132