NGF对黏菌素致PC12细胞自噬和凋亡的影响研究

发布时间：2017-04-08 16:38

  本文关键词：NGF对黏菌素致PC12细胞自噬和凋亡的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：黏菌素(colistin)是多黏菌素类抗菌剂的一种,是对抗多重耐药性绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌引发感染有效手段。然而黏菌素的神经毒性与肾毒性妨碍了它在临床上的应用,随着革兰氏阴性菌耐药性增强,黏菌素作为窄谱抗生素在抗菌方面的优势逐步体现出来。降低黏菌素的毒副作用,有助于黏菌素在临床上的应用。神经生长因子(NFG)是神经营养因子(NT)的一种,能够在神经元受到损伤时起到保护神经元的作用,增强神经元的活性。细胞自噬和细胞凋亡在细胞的正常生理活动中有重要作用。细胞通过自噬可以消化细胞内的长寿命蛋白以及细胞器。当细胞受到刺激时也可以激活细胞自噬,例如缺乏氨基酸或者是细胞生理刺激等。本试验以NGF作为黏菌素毒副作用的保护剂与黏菌素共同作用于大鼠嗜铬细胞瘤(PC12),探究NGF对细胞活性的保护作用以及细胞自噬在细胞凋亡中的作用。在之前的研究中我们发现,当PC12细胞在接种125、250μg?mL-1 colistin 12 h时,细胞发生自噬和凋亡的程度比较高,并且从western blot试验结果发现细胞内的Caspase-3蛋白含量在与colistin接触24 h时最高。在250μg?mL-1 colistin浓度组中随着自噬程度的增加,细胞凋亡越明显,最终确定黏菌素的浓度为250μg·m L-1。PC12细胞在终浓度分别为NGF(25、50、100 ng·mL-1)和250μg?mL-1 colistin共同作用12,24 h。细胞自噬可以通过单丹磺酰尸胺(MDC)方法观察细胞质内空泡,LC3免疫荧光显微镜观测细胞荧光颗粒和蛋白免疫印迹(western blot)测定细胞自噬相关蛋白。细胞凋亡可以通过Hoechst 33258染色染色细胞核、流式细胞仪测定细胞活力和细胞线粒体膜电位、及western blot测定细胞凋亡相关蛋白等方法检测。试验结果表明:(1)黏菌素能够引起PC12细胞自噬和细胞凋亡,250μg?mL-1 colistin与细胞作用24 h时凋亡率最高,作用12 h组时细胞自噬程度最高。(2)随着NGF浓度的增加,试验组的PC12细胞活性提高。(3)细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量以及细胞凋亡率随NGF浓度的增加均有所下降。(4)不同浓度的NGF与250μg?m L-1 colistin接触12,24 h,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的蛋白在细胞内的表达量也有所下降。综上所述,NGF可以提高PC12细胞的细胞活性;高浓度的colistin引起的PC12细胞的自噬可能对细胞凋亡是一种促进机制;NGF不仅能够抑制colistin介导的PC12细胞凋亡,同时也可以抑制PC12细胞自噬。
【关键词】：神经营养因子 自噬 细胞凋亡 黏菌素 PC12细胞
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要9-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-21
• 1.1 黏菌素概述12-13
• 1.1.1 黏菌素理化性质12
• 1.1.2 黏菌素的肾毒性12
• 1.1.3 黏菌素的神经毒性12-13
• 1.1.4 黏菌素药动学13
• 1.1.5 黏菌素抗菌机理13
• 1.2 神经生长因子（NGF）13-15
• 1.2.1 NGF的概述13-14
• 1.2.2 NGF信号传递途径14
• 1.2.3 NGF神经保护作用14
• 1.2.4 NGF临床应用及展望14-15
• 1.3 细胞自噬15-17
• 1.3.1 细胞自噬的概述15
• 1.3.2 细胞自噬的过程15-16
• 1.3.3 细胞自噬的两面性16-17
• 1.3.4 细胞自噬实际应用17
• 1.4 细胞凋亡17-19
• 1.4.1 细胞凋亡的概述17
• 1.4.2 细胞凋亡调控因子17
• 1.4.3 细胞凋亡的过程17-18
• 1.4.4 细胞凋亡途径18-19
• 1.5 课题研究的目的意义19-21
• 2 材料与方法21-35
• 2.1 试验细胞21
• 2.2 试验设备21-22
• 2.3 主要试剂22-25
• 2.3.1 主要试剂的配制23
• 2.3.2 其他试剂的配制23-25
• 2.4 PC12细胞的培养25-27
• 2.4.1 PC12细胞的复苏25
• 2.4.2 PC12细胞的传代25-26
• 2.4.3 PC12细胞的冻存26
• 2.4.4 细胞计数26
• 2.4.5 检测细胞活性26-27
• 2.5 NGF对PC12细胞的保护作用27-34
• 2.5.1 试验分组27
• 2.5.2 细胞活性的检查27
• 2.5.3 Hoechst 33258荧光染色观察细胞活性27
• 2.5.4 MDC荧光染色观察细胞自噬情况27
• 2.5.5 免疫荧光染色标记细胞自噬体27-28
• 2.5.6 细胞透射电镜检测细胞结构28
• 2.5.7 流式细胞仪检测细胞活性28-29
• 2.5.8 RT-PCR半定量分析目标基因的表达29-31
• 2.5.9 Western blot分析PC12中相关蛋白的表达31-33
• 2.5.10 PC12细胞MMP的测定33-34
• 2.6 统计学处理34-35
• 3 结果与分析35-53
• 3.1 细胞活性检测结果35-36
• 3.2 Hoechst33258荧光染色结果36-38
• 3.3 MDC染色结果38-39
• 3.4 免疫荧光染色结果39-40
• 3.5 细胞透射电镜的结果40-42
• 3.6 细胞流式仪检测细胞活性的结果42-43
• 3.7 细胞RT-PCR分析目的基因m RNA的表达结果43-50
• 3.7.1 PC12细胞总RNA提取与鉴定结果43-44
• 3.7.2 PCR产物凝胶电泳鉴定结果44-45
• 3.7.3 RT-PCR检测结果45-50
• 3.8 线粒体膜电位的检测结果50-51
• 3.9 细胞蛋白免疫印迹结果51-53
• 4 讨论53-56
• 4.1 Colistin诱导PC12细胞凋亡和自噬的剂量的确定53
• 4.2 NGF对细胞凋亡的影响53
• 4.3 NGF对细胞自噬的影响53-54
• 4.4 PC12细胞自噬与细胞凋亡的关系54-56
• 5 结论56-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-62
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文62

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈达宏;张良;;神经生长因子治疗脑外伤所致精神障碍的临床研究[J];求医问药(下半月);2011年10期

2 徐立红;细胞凋亡相关的组合生物标志物的分子基础及其在环境毒理学中的意义[J];水生生物学报;2005年03期

3 陈国柱;徐元基;杜芝燕;于晓Y，

本文编号：293252