人源及杂合抗菌肽在乳酸乳球菌中重组分泌表达

发布时间：2017-04-08 20:30

  本文关键词：人源及杂合抗菌肽在乳酸乳球菌中重组分泌表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景目前,随着抗生素的广泛应用,细菌的抗生素耐药率及耐药谱正得到快速增加和扩展,现有的基于微生物种间作用产生的抗生素类抗菌药物将面临前所未有的危机。另外肠道菌群平衡与人体健康有着密切关系,当菌群失调时会导致宿主多种疾病的发生,尤其是肠道疾病,如腹泻、IBD等。抗菌肽(Antibacterial peptides)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptides, AMPs),是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽,但对于人体有益菌则无明显抑菌效果。它作为天然免疫系统的重要组成成分,同时因其广谱抑菌活性和不易产生耐药性的特性,可能成为一种新的控制感染和调节肠道菌群的有效途径[3]。如今已确认被收录入数据库的抗菌肽数目就达到1500多种,种类来源包括细菌、植物、昆虫、两栖动物、无脊椎动物、哺乳动物等。对于人类本身也有自身分泌的抗菌肽,目前人源类抗菌肽研究较多、作用效果广泛的有两大家族,分别是cathelicidins家族和defensins家族。LL-37是迄今为止在人体中发现的唯一一种Cathelicidins家族抗菌肽,广泛存在于胃肠道和泌尿道、呼吸道等组织上皮细胞分泌的中性粒细胞中,在组织受到炎症、感染和损伤时LL-37分泌明显增加。LL-37具有广谱抗菌活性,对多种革兰阳性菌、阴性菌以及真菌均有效,同时LL-37作为免疫调节因子可通过角质细胞释放IL-8来影响宿主炎症应答。人a防御素5(alpha human defensin-5,简称HD5)是防御素家族中一个重要的抗菌肽,它主要在小肠潘氏细胞中大量分泌表达,可随着肠道中受到炎症、感染和细胞恶性转化等因素的刺激而上调分泌表达。HD5不仅具有高效的广谱抑杀病原菌活性和能在免疫调节起到保护作用,还可以抗HIV、HSV等病毒作用。鉴于抗菌肽的多种活性功能,在研发新型抗菌药物及协同调节免疫方面得到了更多的关注。现今,抗菌肽主要从天然资源中提取,但成本高、得率低、工序繁琐等制约着其广泛应用；而化学合成法则价格相对昂贵,也难以应用于临床。利用基因工程技术生产抗菌肽则具有重要意义。乳酸菌作为与人类生活紧密相关的益生菌,被公认为安全的食品级微生物(generally regarded as safe, GRAS)。它不仅能抑制有害菌生长,也能促进营养物质的合成,改善胃肠道功能,治疗胃肠道疾病。本实验选用乳酸乳球菌中nisin(乳链菌肽)调控表达系统(nisin-controlled gene expression,NICE),它是乳酸菌中应用最广泛、可控性最强的表达系统。通过乳酸菌表达系统和SOE(gene splicing by overlap extension)人工合成目的抗菌肽基因获得人源和杂合抗菌肽的蛋白分泌表达,研究其体外抗菌活性,同时体现益生菌和抗菌肽的协同作用,为后续动物及临床实验提供基础。目的1、根据天然人源抗菌肽LL-37和HD5的基因序列设计活性更好的杂合抗菌肽LLD1和LLD2。2、体外拼装合成四条抗菌肽LL-37、HD5、LLD1和LLD2,并构建重组分泌型表达载体pNZ8148-sp-LL37/HD5/LLD1/LLD2,最终在乳酸乳球菌NZ9000中分泌表达。方法1、选取抗菌肽LL-37与抗菌肽HD5作为杂合设计的蓝本,在GenBank中找到此两条抗菌肽的基因序列,根据乳酸乳球菌的偏爱密码子从新优化它们的基因序列,以使其能在乳酸乳球菌中更好的表达。最终设计了两条杂合抗菌肽LLD1和LLD2的基因序列,并通过生物信息学方法对此总共四条抗菌肽的二级结构、两亲性、等电点、跨膜区域等方面进行分析预测,从中比较它们之间的抗菌活性。2、根据乳酸乳球菌表达偏爱密码子的数据库,得到优化后的四条抗菌肽基因序列。分别将每条抗菌肽的基因全序列分为4段,设计成具有18-20bp的重叠引物,利用重叠延伸PCR方法扩增合成抗菌肽基因全序列,并在基因序列两端引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I。最后将合成的四条抗菌肽基因分别与质粒pMD19-T simple连接构建重组质粒,用化学转化法转化到大肠杆菌Top10中。得到阳性克隆子后,提取质粒,用双酶切鉴定法和基因测序进行验证。3、将验证正确的四种抗菌肽重组子进行双酶切,切胶回收抗菌肽基因序列片段,与分泌型表达载体pNZ8148-sp质粒连接,电转化到乳酸乳球菌NZ9000中,构建四种重组乳酸菌。通过菌液PCR法、双酶切法和基因测序鉴定阳性转化子。挑取验证正确的重组乳酸菌进行培养,经过nisin诱导剂诱导后,四种抗菌肽分别得到分泌表达,通过Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blot和Dot Blot鉴定表达产物。利用截留分子量为30KD和1KD的超滤离心管分步进行超滤离心浓缩上清表达产物,得到较为纯化的上清液进行抑菌活性实验。实验结果1、我们通过乳酸乳球菌的偏爱密码子,重新设计抗菌肽LL-37和HD5的基因序列,并以此为母本,杂合设计出两条新的抗菌肽LLD1和LLD2。经过生物信息学分析,抗菌肽LLD1、LLD2、HD5、LL-37都属于α-螺旋结构为主的阳离子型抗菌肽,它们的C-端都具有两亲性。两亲性表现明显的抗菌肽LLD2,它的C端疏水性最强。四条抗菌肽均没有没有明显的跨膜螺旋区域,意味着它们也许并不是传统意义的跨膜蛋白,其作用机制可能与通过静电引力与细胞膜相结合,进而形成穿膜孔洞相关。经过一系列分析后,整体来讲,经过杂合的抗菌肽LLD2可能比其它三条抗菌肽的抗菌活性更强。2、利用设计合成好的互补引物,通过重叠延伸PCR成功合成目的抗菌肽基因的全长序列。本实验合成抗菌肽LLD1基因全长为100bp,LLD2基因全长为112bp,HD5基因全长为115bp,LL37基因全长为130bp,经电泳结果分析,与预期扩增片段大小一致。经过双酶切鉴定和基因测序均显示验证正确。表明已成功克隆LLD1、LLD2、HD5和LL37四条目的片段,将该重组质粒分别命名为pMD19Ts-LLD1、pMD19Ts-LLD2、pMD19Ts-HD5 和 pMD19Ts-LL37。3、经过菌液PCR验证,四条目的载体pNZ8148-sp-LLD1/LLD2/HD5/LL37的预计合成片段大小分别为400bp,412bp,415bp和430bp。在相对应的泳道位置上均可见单一的明亮条带,并大小一致,说明重组乳酸菌转化成功。根据双酶切和基因测序鉴定结果,表明重组分泌表达抗菌肽的乳酸乳球菌构建成功。最终得到4种重组乳酸乳球菌,分别命名为NZ9000-SLLD1, NZ9000-SLLD2, NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37.对四种重组乳酸菌的发酵上清液分别进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测,在3.5-5KDa位置之间均可看到明亮的条带,与预计的抗菌肽蛋白大小一致。并经过免疫检测,确认四种抗菌肽蛋白均得到正确分泌表达。上清表达产物经过纯化浓缩后进行抑菌实验检测,可看到四种抗菌肽均有表现出抑菌效果。并应用不同体积的发酵上清进行独立的抑菌试验,发现当上清达到10mL时,大肠杆菌会被基本抑制生长。但在牛津杯抑菌实验过程中,抑菌的重现性欠佳,由于选用的人源抗菌肽本身对益生菌无明显抑菌作用,因此主要考虑为诱导过程中抗菌肽受到宿主细胞中蛋白酶的影响及纯化条件不足导致蛋白纯度和浓度不够。可进一步完善样品纯化工艺,确保检测样品的稳定性。结论1、为得到抗菌活性更强的抗菌肽以及能更易获取抗菌肽和让其更好的针对人体肠道疾病的治疗,本实验针对如何提高抗菌肽活性进行了杂合设计和一系列的生物信息学研究,并且利用分子克隆技术构建重组益生菌另其得以源源不断表达目的抗菌肽。2、本实验以抗菌肽HD5和LL37为蓝本进行杂合,设计了杂合抗菌肽LLD1和LLD2。利用生物信息学软件对四条抗菌肽序列进行等电点、两亲性、二级结构以及跨膜结构等预测分析,可以发现,抗菌肽LLD1、LLD2、HD5和LL37的等电点都大于7,它们的结构都是以α-螺旋结构为主。而且,经过杂合后的两条抗菌肽,尤其是抗菌肽LLD2,具有较母肽HD5和LL37更好的抑菌活性。3、本实验利用重叠延生PCR法合成四条抗菌肽基因LLD1、LLD2、HD5和LL37,并在pMD19-T simple载体中成功克隆,得到正确的抗菌肽基因序列。4、 本实验成功构建重组分泌型表达载体pNZ8148-sp-LLD 1/LLD2/HD5/LL37,最终转化到益生菌乳酸乳球菌NZ9000中,成功构建了4种转化基因工程菌NZ9000-SLLD1,NZ9000-SLLD2,NZ9000-SHD5和NZ9000-SLL37,并成功进行了诱导表达。将含抗菌肽的发酵上清进行抑菌实验,可见四种抗菌肽均有表现出抑菌效果。但由于样品纯化工艺存在不足,抗菌肽的纯度和浓度欠佳,抑菌效果并不是十分稳定。5、在现有研究的基础上,在以下方面还有待进一步研究和提高：(1)提高抗菌肽的表达量和稳定性。(2)进一步进行动物实验,验证其在肠道菌群中的调节作用和对肠道免疫屏障的防御作用。(3)进一步改善抗菌肽基因的设计,研制更高效能的抗菌肽。
【关键词】：人源抗菌肽 杂合抗菌肽 乳酸乳球菌 分泌表达
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915;Q78
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-19
• 第一章 绪论19-31
• 1.1 抗菌肽的生物学特征19-20
• 1.1.1 抗菌肽来源19
• 1.1.2 抗菌肽的理化性质和决定因素19-20
• 1.1.3 抗菌肽的结构多样性20
• 1.2 抗菌肽的作用机制20-25
• 1.2.1 抗菌活性21-23
• 1.2.2 抗病毒活性23-24
• 1.2.3 抗真菌活性24
• 1.2.4 抗寄生虫活性24-25
• 1.2.5 免疫调节及进一步活动25
• 1.3 抗菌肽的临床应用及前景25-28
• 1.3.1 作为抗菌消炎药的临床应用26-27
• 1.3.2 抗肿瘤药物27-28
• 1.3.3 免疫调节28
• 1.4 药物载体28-29
• 1.5 面临的问题29-30
• 1.5.1 抗菌肽产品的来源问题29
• 1.5.2 抗菌肽的活性问题29-30
• 1.5.3 抗菌肽的毒性问题30
• 1.5.4 抗菌肽的体内稳定性问题30
• 1.5.5 抗菌肽的耐药性问题30
• 1.6 展望30-31
• 第二章 杂合抗菌肽的分子设计及结构预测31-41
• 2.1 实验方法31-33
• 2.1.1 抗菌肽母本选择31-32
• 2.1.2 杂合原理32
• 2.1.3 生物信息学分析32-33
• 2.2 结果与分析33-39
• 2.2.1 抗菌肽序列33
• 2.2.2 抗菌肽的理化性质分析33-34
• 2.2.3 二级结构分析34-36
• 2.2.4 跨膜预测36-37
• 2.2.5 抗菌肽两亲性分析37-39
• 2.3 结论与讨论39-41
• 第三章 人源及杂合抗菌肽基因的合成41-54
• 3.1 实验材料41-42
• 3.1.1 实验菌种与质粒41
• 3.1.2 实验主要仪器41
• 3.1.3 实验主要试剂及试剂盒41-42
• 3.1.4 培养基及其配制42
• 3.1.5 其它试剂及其配制42
• 3.2 实验方法42-49
• 3.2.1 引物设计42-44
• 3.2.2 基因合成44
• 3.2.3 2%琼脂糖凝胶电泳44-45
• 3.2.4 目的基因的回收与纯化45-46
• 3.2.5 目的基因克隆连接46-47
• 3.2.6 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞47
• 3.2.7 转化大肠杆菌47
• 3.2.8 重组菌质粒提取47-48
• 3.2.9 阳性克隆子双酶切鉴定48-49
• 3.2.10 基因测序鉴定49
• 3.3 结果与分析49-52
• 3.3.1 全长基因合成49
• 3.3.2 重组子双酶切验证49-51
• 3.3.3 目的基因测序验证51-52
• 3.4 结论与讨论52-54
• 第四章 抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表达及作用54-76
• 4.1 实验材料56-59
• 4.1.1 实验菌种与质粒56
• 4.1.2 实验主要仪器56
• 4.1.3 实验试剂及试剂盒56
• 4.1.4 培养基及其配制56-57
• 4.1.5 主要试剂及其配制57-59
• 4.2 实验方法59-66
• 4.2.1 目的抗菌肽基因提取59
• 4.2.2 乳酸菌质粒DNA提取59
• 4.2.3 重组大肠杆菌mc1061的构建59-60
• 4.2.4 重组大肠杆菌mc1061的鉴定60
• 4.2.5 乳酸菌感受态细胞的制备60-61
• 4.2.6 乳酸菌感受态细胞的电击转化61
• 4.2.7 转化子的筛选61
• 4.2.8 转化子的酶切及测序61-62
• 4.2.9 重组乳酸菌的诱导表达及提取62
• 4.2.10 上清表达产物的纯化62
• 4.2.11 重组蛋白的电泳鉴定——Tricine-SDS-PAGE电泳62-64
• 4.2.12 重组蛋白免疫检测——Western Blot和Dot Blot64-66
• 4.2.13 上清表达产物抑菌活性检测66
• 4.3 结果与分析66-73
• 4.3.1 重组乳酸菌菌液PCR鉴定66-67
• 4.3.2 重组乳酸菌双酶切鉴定67-68
• 4.3.3 重组乳酸菌测序鉴定68-69
• 4.3.4 蛋白凝胶电泳分析69-70
• 4.3.5 蛋白免疫检测分析70-71
• 4.3.6 抑菌实验71-73
• 4.4 结论与讨论73-76
• 第五章 结论与展望76-78
• 5.1 结论76
• 5.2 展望76-78
• 参考文献78-88
• 在读期间已经发表和将要发表的论文88-89
• 致谢89-90

【共引文献】

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