氧氟沙星—绕丹宁衍生物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用研究

发布时间：2017-04-10 22:35

  本文关键词：氧氟沙星—绕丹宁衍生物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自1962年喹诺酮类药物诞生,氟喹诺酮类抗菌剂一直被临床广泛应用。喹啉羧酸结构是喹诺酮类药物的骨架,通过抑制细菌DNA旋转酶的活性发挥作用,而真核细胞的拓扑异构酶Ⅱ与DNA旋转酶具有高度的同源性,氟喹诺酮羧酸对肿瘤细胞增殖也具有微弱的抑制作用。相关研究证明,氟喹诺酮碳-3羧基是将氟喹诺酮抗菌药物改造成为抗肿瘤药物的有效部位。本课题组通过氟喹诺酮化合物碳-3位与不同的活性药效团的拼合,已获得若干活性较强的抗肿瘤化合物,如肉桂醛氧氟沙星酰腙、对甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙,苯甲醛左氧氟沙星席夫碱等,能够显著抑制肿瘤细胞增殖,通过线粒体或(和)受体凋亡通路诱导人肝癌细胞凋亡,其24 h的IC50值均低于10μmol/L。应用pBR322质粒DNA电泳实验已证明肉桂醛氧氟沙星酰腙衍生化合物为DNA拓扑异构酶II毒剂,能够造成DNA损伤。但合成的多种化合物均因分子质量大,溶解度低,影响细胞摄入等原因影响进一步的应用开发,需进一步改进。绕丹宁属五元杂环酮,结构与类黄酮相似,在绕丹宁取代基上引入侧链,增加溶解度,常被用于新药合成。将氟喹诺酮骨架经绕丹宁骨架修饰的设计,国内外目前尚未见报道。本课题组设计合成了一系列溶解性好,分子质量较小的氟喹诺酮-绕丹宁结合的新型化合物,期望得到抗肿瘤活性显著的临床候选化合物。目的 通过对数十种新合成的氟喹诺酮衍生物的筛选,寻找并选择对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显生长抑制作用的化合物,初步探索其诱导凋亡作用,为此类化合物的开发利用提供实验基础及理论基础。方法 MTT法检测氟喹诺酮衍生物及其他药物对细胞的增殖影响;DAPI荧光染色法检测所选化合物对SMMC-7721细胞造成的细胞核形态学变化;TUNEL法检测细胞凋亡率;流式细胞术PI染色法检测细胞周期变化;Western Blot法测定凋亡信号通路相关蛋白p53、Caspase-3表达量的变化。结果 前期经大量筛选,寻找出12抗肿瘤活性较明显的饶丹宁-氟喹诺酮类衍生物,其中R1,R3,R4和R5对细胞的增殖抑制作用均较显著,其中6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1,8-(2-甲基亚乙氧基)-1,4-二氢-4-氧代-3-(3-苄基-2-硫氧代噻唑啉-4-酮-5-叉甲基)喹啉(氧氟沙星-绕丹宁衍生物),R3,对细胞的增殖抑制作用效果最为显著,在2~20mmol/L的浓度范围内能明显抑制SMMC-7721细胞、CaCO-2细胞和EC-9706细胞的增殖;对SMMC-7721细胞24h IC_(50)值达到3.893mmol/L(r~2=0.8304),48 h为3.849mmol/L(r~2=0.7706),72 h为2.892mmol/L(r~2=0.7558),对EC-9706细胞和CaCO-2细胞的24h IC_(50)值分别是4.181mmol/L(r~2=0.8833)、3.408mmol/L(r~2=0.9601);作为对照,舒尼替尼作用于SMMC-7721细胞24h的IC50值为8.075mmol/L(r~2=0.9845);氧氟沙星盐酸盐作用于SMMC-7721细胞24h的IC50值为240.137mmol/L(r~2=0.8005);R3作用于L-02细胞24 h的IC50值为33.959mmol/L(r~2=0.9309)。DAPI染色观察细胞核形态改变的结果显示,R3处理后,SMMC-7721细胞表现出细胞核固缩、碎裂,染色质凝集、边缘化和凋亡小体出现等特征性凋亡形态学改变。TUNEL法结果显示,浓度分别为2.688mmol/L,3.893mmol/L和5.639mmol/L的R3处理组的细胞凋亡率分别是(34.44±4.53)%,(48.40±7.52)%和(62.27±6.86)%,与对照组相比细胞凋亡率显著升高。细胞的周期检测结果显示,对照组及浓度分别为2.688mmol/L,3.893mmol/L和5.639mmol/L的R3处理组的G_0/G_1期细胞比值分别为(36.08±1.82)%,(54.24±9.08)%,(62.84±4.74)%和(69.78±4.60)%,S期细胞比值分别为(28.50±3.33)%,(17.31±6.66)%,(30.65±4.71)%和(24.79±4.03)%,G_2/M期细胞比值分别为(35.41±3.62)%,(28.45±3.30)%,(6.53±0.54)%和(5.34±1.01)%,Sub-G_1期细胞比值分别为(2.44±0.44)%,(11.31±4.08)%,(18.90±2.37)%和(31.15±4.86)%,G_0/G_1期,G_2/M期和Sub-G_1期变化与对照组相比具有显著差异,S期细胞变化与对照组无显著差异,表明R3处理SMMC-7721细胞后,细胞周期被阻滞,增殖阻断点在G_1-S期检测点。Western Blot结果显示,R3处理后,P53蛋白表达量、Caspase-3蛋白表达量及其活性裂解小片段增加。结论 (1)氟喹诺酮衍生物R3主要通过阻断G_1-S期检测点显著抑制肿瘤细胞的增殖,并且对肿瘤细胞具有较好的选择抑制作用。(2)R3能够显著诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。
【关键词】：氧氟沙星-绕丹宁衍生物 肝癌 细胞凋亡 p53
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 1 材料、试剂与仪器13-19
• 1.1 细胞培养13
• 1.2 主要材料、试剂13-15
• 1.3 主要试剂配制15-16
• 1.4 主要仪器16-19
• 2 实验方法19-23
• 2.1 MTT法测定细胞增殖改变19-20
• 2.1.1 细胞浓度标准曲线19
• 2.1.2 细胞增殖抑制率的检测19-20
• 2.2 DAPI染色观察细胞核形态改变20
• 2.3 TUNEL法检测细胞凋亡率20
• 2.4 PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化20
• 2.5 Western Blot检测p53和Caspase-3 蛋白表达变化20-22
• 2.5.1 提取细胞总蛋白20-21
• 2.5.2 BCA蛋白定量试剂盒测定细胞总蛋白量21
• 2.5.3 蛋白凝胶电泳21-22
• 2.5.4 蛋白质电转印22
• 2.5.5 化学增强发光法显色22
• 2.6 统计学分析22-23
• 3 实验结果23-33
• 3.1 12种氟喹诺酮类-饶丹宁衍生物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用23
• 3.2 R3对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用23-26
• 3.3 R3对EC-9706细胞的增殖抑制作用26
• 3.4 R3对CaCO-2 细胞的增殖抑制作用26-27
• 3.5 R3对L-02细胞的增殖抑制作用27
• 3.6 氧氟沙星对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用27
• 3.7 舒尼替尼对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用27-28
• 3.8 R3、舒尼替尼及氧氟沙星对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用比较28
• 3.9 R3对SMMC-7721细胞与L-02细胞的增殖抑制作用比较28-29
• 3.10 DAPI染色法观察细胞凋亡后细胞核形态学方面的变化情况29
• 3.11 TUNEL法测定细胞的凋亡率改变29-30
• 3.12 流式细胞术检测R3诱导凋亡作用后的周期变化30-31
• 3.13 R3对细胞p53蛋白的影响31
• 3.14 R3对细胞Caspase-3 蛋白的影响31-33
• 4 讨论33-35
• 5 结论35-37
• 参考文献37-42
• 文献综述42-56
• 参考文献50-56
• 附录A 英文缩略词对照表56-58
• 附录B 攻读学位期间发表的学术论文情况58-60
• 致谢60-62

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本文编号：297694