基质辅助激光解吸电离质谱成像技术在生物碱中的应用研究
发布时间：2021-02-04 06:30
目的:利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术建立食品及中药材样品组织中生物碱的可视化分布。（1）研究不同贮藏时间下,四种有毒糖苷生物碱在马铃薯块茎中的三个不同组织部位（芽、周皮和髓质）的成像分布及变化规律;（2）探讨了一种基于砂纸的简单、快速的新型样品制备方法,并在中药贝母的生物碱成像分布中得到了具体应用。研究方法:（1）市售马铃薯块茎样品在室温条件下,分别贮藏0,10,15,20,30,40,60天。分别取样后,样品经液氮快速冷冻,并在–18 oC的冷冻切片机内进行组织切片,随后将薄片迅速转移到涂有氧化铟锡层（ITO）的导电载玻片上。随后将其置于成像质谱显微镜（iMScope）仪器上采集光学图像。采用2,5-二羟基苯甲酸（DHB）作为基质及“两步结合法”的基质喷涂方法来检测马铃薯块茎中的糖苷生物碱。在正离子模式下对组织切片进行一级和二级质谱电离。采用Logistic方程中的Growth/sigmoidal模型对马铃薯块茎中的糖苷生物碱生长趋势进行了拟合和预测;（2）中药贝母在–20 oC的冷冻切片机内进行组织切片,利用导电双面胶辅助转移薄片至...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
典型的甾体生物碱结构示意图
中国医科大学硕士学位论文3[25]。飞行时间检测器（TOF）是MALDI最常联用的质谱分析仪，其具有速度快、灵敏度高和质量范围宽（m/z,1-100000）等独特的优势。基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrixassistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometryimaging,MALDI-MSI）技术是一项引人注目的新技术，最早由Caprioli等人[26]提出。该技术具有无标记、高灵敏度、高通量、分子特异性强、能一次从组织样本中同时定位多种生物分子等特点，广泛应用到临床、药学、环境、食品等各个领域[27-29]。MALDI-MSI的具体过程如下，首先对样品组织进行切片并使其粘贴在导电载破片上，随后将基质通过各种沉积方法（升华法、喷雾法、重结晶法等）均匀的喷涂于样品组织表面[30]。待测物分子被均匀扩散到有机基质分子中，并形成共结晶。随后使用激光照射形成的共结晶，基质分子吸收激光能量，导致结晶升华，从而使样品中的待测物分子从共结晶表面解吸，基质和待测物发生膨胀，进行气相质子交换，实现待测物离子化，离子化分子在电场或负压作用下进入质谱部分。最后利用特定的质谱成像软件重构样品组织的质谱信息，即将质谱仪所获得的样品上每个点的质谱信息转化为样品组织上的像素点，完成对组织样品的可视化分子成像。典型的MALDI-MSI流程如图2所示。图2典型的MALDI-MSI技术的工作流程图近年来，随着MALDI新基质的开发和离子化技术的改进，MALDI-MSI逐渐
中国医科大学硕士学位论文12为了进一步比较这些基质在MALDI-MSI分析中的沉积和电离能力，我们还在马铃薯块茎的空白组织切片上比较了不同基质对α-茄碱的灵敏度和选择性。基质溶液（20mg/mL）和α-茄碱（1mg/mL）以1:1的比例混合。然后将该混合物溶液滴加到喷枪的空腔中，并连续喷洒在粘贴有20μm马铃薯块茎切片的导电玻璃片上，间隔30s循环10次。待有机溶剂蒸发后，将导电载玻片安装在质谱显微镜内，借助放大20倍的CCD摄像机确定成像区域。如图4e,f,g,h所示，DHB、CHCA喷涂的组织切片可以明显观察到α-茄碱的相关离子（[M+H]+,m/z868.5）信号，而2,4,6-THAP和SA基质处理的切片α-茄碱信号响应较弱，甚至无α-茄碱信号。这一结果表明，采用MALDI-MSI检测马铃薯块茎中的GAs时，DHB和CHCA基质对GAs具有较高的选择性。值得注意的是，DHB喷涂的组织切片，α-茄碱离子强度远高于CHCA处理的切片。此外，CHCA晶体具有非均匀分布的特点，分析物未被基质完美包裹，对目标物成像不利。根据以上实验结果，我们最终选择DHB作为GAs检测的基质。图3MALDI-TOF-MSI检测不同基质下α-茄碱的离子峰（α-茄碱浓度：1mg/mL，每种基质浓度：20mg/mL）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]质谱成像技术在食品科学领域的应用进展[J]. 唐雪妹,谢书越,黄玉芬,万凯,王富华. 食品科学. 2019(13)
[2]甾体生物碱定量分析方法的研究进展[J]. 杨炳友,许振鹏,刘艳,匡海学. 中国实验方剂学杂志. 2018(16)
[3]基质辅助激光解吸电离质谱成像技术及其在食品分析中的应用[J]. 殷小钰,陈倩,韩齐,孔保华. 食品科学. 2018(07)
[4]酸性染料比色法测定浙贝母中总生物碱的含量[J]. 丁霞,李幼荣,房克慧. 中国药业. 1999(10)
硕士论文
[1]贝母生物碱组分的制备与质量评价方法建立[D]. 刘建梅.华东理工大学 2014
[2]川贝母生物碱成分与品质研究[D]. 王晓静.四川大学 2004
本文编号：3017890
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
典型的甾体生物碱结构示意图
中国医科大学硕士学位论文3[25]。飞行时间检测器（TOF）是MALDI最常联用的质谱分析仪，其具有速度快、灵敏度高和质量范围宽（m/z,1-100000）等独特的优势。基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrixassistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometryimaging,MALDI-MSI）技术是一项引人注目的新技术，最早由Caprioli等人[26]提出。该技术具有无标记、高灵敏度、高通量、分子特异性强、能一次从组织样本中同时定位多种生物分子等特点，广泛应用到临床、药学、环境、食品等各个领域[27-29]。MALDI-MSI的具体过程如下，首先对样品组织进行切片并使其粘贴在导电载破片上，随后将基质通过各种沉积方法（升华法、喷雾法、重结晶法等）均匀的喷涂于样品组织表面[30]。待测物分子被均匀扩散到有机基质分子中，并形成共结晶。随后使用激光照射形成的共结晶，基质分子吸收激光能量，导致结晶升华，从而使样品中的待测物分子从共结晶表面解吸，基质和待测物发生膨胀，进行气相质子交换，实现待测物离子化，离子化分子在电场或负压作用下进入质谱部分。最后利用特定的质谱成像软件重构样品组织的质谱信息，即将质谱仪所获得的样品上每个点的质谱信息转化为样品组织上的像素点，完成对组织样品的可视化分子成像。典型的MALDI-MSI流程如图2所示。图2典型的MALDI-MSI技术的工作流程图近年来，随着MALDI新基质的开发和离子化技术的改进，MALDI-MSI逐渐
中国医科大学硕士学位论文12为了进一步比较这些基质在MALDI-MSI分析中的沉积和电离能力，我们还在马铃薯块茎的空白组织切片上比较了不同基质对α-茄碱的灵敏度和选择性。基质溶液（20mg/mL）和α-茄碱（1mg/mL）以1:1的比例混合。然后将该混合物溶液滴加到喷枪的空腔中，并连续喷洒在粘贴有20μm马铃薯块茎切片的导电玻璃片上，间隔30s循环10次。待有机溶剂蒸发后，将导电载玻片安装在质谱显微镜内，借助放大20倍的CCD摄像机确定成像区域。如图4e,f,g,h所示，DHB、CHCA喷涂的组织切片可以明显观察到α-茄碱的相关离子（[M+H]+,m/z868.5）信号，而2,4,6-THAP和SA基质处理的切片α-茄碱信号响应较弱，甚至无α-茄碱信号。这一结果表明，采用MALDI-MSI检测马铃薯块茎中的GAs时，DHB和CHCA基质对GAs具有较高的选择性。值得注意的是，DHB喷涂的组织切片，α-茄碱离子强度远高于CHCA处理的切片。此外，CHCA晶体具有非均匀分布的特点，分析物未被基质完美包裹，对目标物成像不利。根据以上实验结果，我们最终选择DHB作为GAs检测的基质。图3MALDI-TOF-MSI检测不同基质下α-茄碱的离子峰（α-茄碱浓度：1mg/mL，每种基质浓度：20mg/mL）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]质谱成像技术在食品科学领域的应用进展[J]. 唐雪妹,谢书越,黄玉芬,万凯,王富华. 食品科学. 2019(13)
[2]甾体生物碱定量分析方法的研究进展[J]. 杨炳友,许振鹏,刘艳,匡海学. 中国实验方剂学杂志. 2018(16)
[3]基质辅助激光解吸电离质谱成像技术及其在食品分析中的应用[J]. 殷小钰,陈倩,韩齐,孔保华. 食品科学. 2018(07)
[4]酸性染料比色法测定浙贝母中总生物碱的含量[J]. 丁霞,李幼荣,房克慧. 中国药业. 1999(10)
硕士论文
[1]贝母生物碱组分的制备与质量评价方法建立[D]. 刘建梅.华东理工大学 2014
[2]川贝母生物碱成分与品质研究[D]. 王晓静.四川大学 2004
本文编号：3017890
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