靶向肿瘤相关蛋白CBP bromodomain小分子抑制剂的发现及作用机制的研究

发布时间：2021-02-23 11:24

　　目的:在过去的几十年间,许多肿瘤表观遗传学研究表明,异常的组蛋白修饰是肿瘤发生发展的动力。组蛋白乙酰化是表观遗传学中一类至关重要的翻译后修饰,不仅在基因转录和染色体形成中扮演重要角色,更是与多种肿瘤疾病密切相关。cAMP反应元件结合蛋白（CREB）结合蛋白（CBP）和腺病毒E1A结合蛋白（P300）是两种密切相关的多功能转录辅助激活因子。这两种蛋白都包含有一个毗邻乙酰化催化结构域（HAT domain）的溴域（Bromodomain）,该溴域是非BET家族溴域的重要成员之一。大量研究发现,CBP bromodomain是一个非常有前景的治疗多种癌症和免疫调节疾病的药物靶点。然而,靶向非BET家族溴域的小分子抑制剂却非常匮乏。方法:在本文中,我们对CBP bromodomain和乙酰化H4多肽这对互作蛋白建立并优化了基于HTRF技术的高通量筛选平台,并对实验室自建的化合物库进行高通量筛选。我们采用表面等离子体共振实验来测定CBP bromodomain的K_D值,利用分子对接分析结合模式,测定DC_CP20衍生物的活性,分析了构效关系。随后,我们测... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

3CBPbromodomain部分现有抑制剂结构

CBPbromodomain 是组蛋白乙酰化的“读码器”（reader）,其相互作用的底物以是组蛋白，也可以是 p53 等非组蛋白。溴域蛋白进行药物筛选，可以采用虚筛选（virtual screening，VS）和高通量筛选两种筛选方法。如图 1.1.6 所示，虑到虚拟筛选的特异性比较差，再根据文献报道，结合实验室现有条件，我们择组蛋白 H4 Kac 5/8/12/16 的四乙酰化多肽[N-C:SGRG-K(Ac)-GG-K(Ac)-LG-K(Ac)-GGA-K(Ac)-RHRKVGG-K(biotin)]作为其相互作用的底物，对 CBPomodomain 进行高通量筛选。由于 CBP bromodomain 蛋白分子量比较小，我选择适合表达小分子量蛋白、操作简便的大肠杆菌原核表达系统来表达蛋白。到蛋白后，可以先做个蛋白热迁移实验，加现有的阳性抑制剂作对照，验证蛋的可靠性。确定蛋白没有问题后，我们需要摸索实验的稳定窗口值以及达到这窗口所需要的蛋白和多肽的浓度和加样体积。确定上述条件后，再检测实验体下的 DMSO 耐受程度以及评价大通量下实验的稳定可靠性。在各种可能影响通量结果稳定性的因素考虑并减小后，再将筛选所需的各类试剂和耗材准备全。最后，调试仪器，确定筛选比例，计算所需的化合物量，稀释好化合物，备加样测板读数。

18图 2.2.1CBPbromodomain 的质粒构建与蛋白纯化 （A）线性化 pGEX-6p-1 载体与modomain 基因片段的 1%琼脂糖凝胶电泳图，1、2 泳道为 pGEX-6p-1 空载，3-8 泳双酶切线性化后，9-12 为目的基因片段；（B）GST 柱与 Superdex75 分子筛纯化后 E 凝胶电泳图，1-5 泳道为 GST 柱纯化后样品，6、7 为 Superdex75 分子筛纯化后样）GST 柱纯化紫外监测传感图；（D）Superdex75 分子筛凝胶层析紫外监测传感图


本文编号：3047507