非病毒多基因纳米传递与成纤维细胞的神经分化研究

发布时间：2017-04-17 09:04

  本文关键词：非病毒多基因纳米传递与成纤维细胞的神经分化研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：直接重编程是指将一种终末分化的细胞直接转变成另一种终末分化的细胞,这一技术的产生为细胞移植在临床中的应用提供了新的细胞来源。在成神经细胞分化的研究中主要依靠病毒载体,而病毒载体本身具有潜在的安全隐患,使该技术的应用受到限制,纳米粒具有安全、高效等优点,已经受到越来越多的关注。本文重点围绕神经细胞的直接重编程展开研究,通过制备乙二胺修饰的阳离子化紫菜多糖,并将其作为基因载体携神经相关转录因子,将小鼠成纤维细胞直接重编程为神经细胞,主要分为四个部分:第一章综述本章对基因治疗中载体的发展进行了简要综述,比较了不同载体的优缺点,对各载体的应用作了简单介绍;并对可用于治疗神经系统疾病的细胞来源,不同来源细胞的优缺点以及细胞来源途径的发展趋势及面临的问题进行了简要叙述,为本学位论文设计思想的提出及后续实验工作的开展奠定基础。第二章阳离子化紫菜多糖的制备及表征本项目研究以紫菜多糖为对象,采用高碘酸钾氧化法对紫菜多糖进行氧化,再利用乙二胺及精胺两种阳离子化试剂分别对氧化后的紫菜多糖进行阳离子化,得到乙二胺阳离子化紫菜多糖(Ed-PYP)和精胺阳离子化紫菜多糖(Sm-PYP),采用傅里叶变换红外光谱分析仪对两种阳离子化的多糖进行结构检测,采用Zeta电位粒径仪对其进行表征,为进一步研究阳离子化紫菜多糖在基因载体中的应用打下基础。第三章乙二胺阳离子化的紫菜多糖作为基因载体的初步探究以阳离子化多糖为载体,成纤维细胞为种子细胞,通过琼脂糖凝胶电泳对Ed-PYP/pDNA复合物表征,采用MTT实验对其进行毒性检测,实验结果初步表明其具有载基因能力。通过绿色荧光蛋白(EGFP)及ELISA分别从可视化角度及蛋白水平来评价Ed-PYP/pDNA复合物的体外转染效率,结果表明在Ed-PYP/pDNA质量比为40:1,其体外转染效率为最佳且优于PEI及Lip2000。通过质粒DNA的荧光标记物YOYO-1以及多种特异性抑制剂考察Ed-PYP/pDNA纳米粒(40:1)的穿膜机制及胞内转运机理。结果表明,Ed-PYP/pDNA复合物是通过网格蛋白以及小窝蛋白介导的Qg吞途径进入胞内,而其在胞内的转运过程是由内涵体-溶酶体系统、细胞骨架结构、中间纤维结构以及动力蛋白多系统参与的。第四章成纤维诱导分化为神经的研究根据前文研究结果,将Ed-PYP与神经相关转录因子的复合物按最佳比例(40:1)混合制成纳米粒(Ed-PYP/pABF、Ed-PYP/pABT)用于转染成纤维细胞,拟对其进行成神经诱导分化,经琼脂糖凝胶电泳、TEM、Zeta电位粒径仪等手段对其进行表征,结果与预实验吻合。通过细胞形态观察及ELISA检测表明诱导第14天时效果最佳。通过免疫荧光以及蛋白免疫印迹进一步鉴定诱导后的成纤维细胞,结果表明,阳离子化紫菜多糖携神经相关转录基因可将成纤维细胞直接重编程为神经细胞。本研究为细胞移植治疗神经系统相关疾病提供了丰富的细胞来源。
【关键词】：成纤维细胞 直接重编程 神经细胞 非病毒载体 多基因
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-14
• 第一章 综述14-26
• 1 载体的发展15-18
• 1.1 基因治疗的概念及发展15
• 1.2 基因转移途径15
• 1.3 基因载体15-18
• 2 神经损伤及细胞治疗18-24
• 2.1 神经系统损伤18-19
• 2.2 细胞疗法19-24
• 2.2.1 胚胎干细胞19-20
• 2.2.2 神经干细胞20
• 2.2.3 骨髓间充质干细胞20-21
• 2.2.4 脐带血干细胞21
• 2.2.5 脂肪干细胞21-22
• 2.2.6 雪旺细胞22
• 2.2.7 嗅鞘细胞22-23
• 2.2.8 诱导多能干细胞23
• 2.2.9 直接重编程细胞23-24
• 3 展望24
• 4 本课题的选题依据以及设计思路24-26
• 4.1 选题依据24-25
• 4.2 设计思路25-26
• 第二章 阳离子化紫菜多糖的制备及表征26-31
• 1 仪器与试剂26-27
• 1.1 仪器26
• 1.2 试剂26-27
• 2 方法27-28
• 2.1 阳离子化紫菜多糖的制备27
• 2.1.1 氧化多糖的制备27
• 2.1.2 阳离子化多糖的制备27
• 2.2 阳离子化多糖的表征27-28
• 2.2.1 红外光谱的测定27-28
• 2.2.2 电位的测定28
• 3 实验结果28-29
• 3.1 红外光谱的测定28
• 3.2 电位的测定28-29
• 4 讨论29-30
• 5 本章小结30-31
• 第三章 乙二胺阳离子化的紫菜多糖作为基因载体的初步探究31-51
• 1 仪器与试剂31-34
• 1.1 仪器31-32
• 1.2 试剂32-33
• 1.3 主要溶液33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 质粒DNA的制备34-36
• 2.1.1 DH5α 感受态的制备34-35
• 2.1.2 质粒DNA转化感受态大肠杆菌35
• 2.1.3 转化克隆的筛选和鉴定35-36
• 2.2 Ed-PYP/pDNA复合物的制备及琼脂糖凝胶电泳36-37
• 2.3 Ed-PYP作为基因载体的初步探究37-41
• 2.3.1 细胞培养37-38
• 2.3.2 Ed-PYP/pDNA细胞毒性的测定38
• 2.3.3 Ed-PYP细胞转染效果考察38-39
• 2.3.4 Ed-PYP/pDNA复合物的体外转染效果39
• 2.3.5 Ed-PYP/pDNA复合物的摄取及转运机理研究39-41
• 3 实验结果41-48
• 3.1 质粒DNA（Ascl1及EGFP）的制备41-42
• 3.2 基因滞留实验结果42
• 3.3 细胞毒性的结果42-43
• 3.4 荧光法测定Ed-PYP/pDNA复合物的转染43-45
• 3.5 ELISA法测定Ed-PYP/pDNA复合物的转染45
• 3.6 Ed-PYP/pDNA复合物的摄取及转运机理研究45-48
• 3.6.1 Ed-PYP/pDNA复合物穿膜机制45-47
• 3.6.2 Ed-PYP/pDNA复合物胞内转运机制47-48
• 4 讨论48-50
• 5 本章小结50-51
• 第四章 成纤维细胞的神经分化51-73
• 1 仪器与试剂51-54
• 1.1 仪器51-52
• 1.2 试剂52-53
• 1.3 主要溶液53-54
• 2 方法54-58
• 2.1 质粒DNA的制备54
• 2.2 Ed-PYP/pDNA复合物的制备54-55
• 2.3 Ed-PYP/pDNA复合物的表征55
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳55
• 2.3.2 电位及粒径测定55
• 2.4 细胞培养55
• 2.5 成纤维细胞向神经细胞直接重编程55-56
• 2.6 神经细胞的鉴定56-58
• 2.6.1 细胞形态学观察56
• 2.6.2 ELISA试剂盒鉴定神经相关因子表达56
• 2.6.3 免疫荧光鉴定（双染）56-57
• 2.6.4 蛋白免疫印迹（Western blotting, WB）57-58
• 3 实验结果58-70
• 3.1 质粒DNA的鉴定58
• 3.2 Ed-PYP/pDNA复合物的表征58-63
• 3.2.1 琼脂糖凝胶电泳58-59
• 3.2.2 Ed-PYP/pDNA复合物的形态及Zeta电位59-63
• 3.3 诱导形态学变化63-64
• 3.4 ELISA检测神经相关蛋白表达64-66
• 3.5 免疫荧光鉴定66-67
• 3.6 蛋白免疫印迹（Western blotting, WB）67-70
• 4 讨论70-72
• 5 本章小结72-73
• 全文总结73-75
• 本文创新点如下75-76
• 参考文献76-87
• 致谢87-88
• 攻读硕士期间发表的相关论文88

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