HIV-1env/HIV-1Δenv假病毒筛选药物体系的建立及化合物WYM-17和WYM-25体外抗HIV-1活性研究
发布时间：2021-04-15 19:28
[目的】建立并优化HIV-1env/HIV-1Aenv假病毒筛选抗HIV-1药物体系,对初筛活性好的化合物进行体外抗HIV-1活性研究。[方法]采用HIV-1包膜质粒pCNE49与HIV-1骨架质粒pNL4-3Luc R-E-共同转染293T细胞来获得HIV-1Luc假病毒,并采用Promega公司的荧光素酶活性分析系统,评价在不同浓度的DEAE-葡聚糖溶液的存在下,HIV-1Luc对TZM-bl细胞的感染力。对不同类型HIV-1上市药物进行抗假病毒活性评价,并与HIV-1mB病毒筛选体系所得结果进行比较,以验证该模型的可行性与有效性。进而将假病毒应用于化合物的抗HIV-1活性筛选。对活性较好的化合物进行进一步的体外抗HIV-1活性评价,包括采用MTT法检测化合物对不同细胞株的毒性作用,ELISA检测p24法、MTT法和荧光素酶分析方法在不同细胞中评价化合物对不同病毒株以及假病毒的抑制活性。[结果]HlV-1Luc对TZM-bl细胞的感染力随着DEAE-葡聚糖溶液浓度的升高显著增加,且荧光素酶报告基因的表达水平与加入的病毒量呈剂量依赖关系。不同阳性药物抑制HIV-1Luc的EC50与H...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２?ｍｖ－ｉ的复制周期ｗ??ＨＩＶ－ｌ进入宿主细胞是一个包括病毒吸附、病毒包膜糖蛋白ｇｐｌ２０与细胞??表面ＣＤ４分子结合、ｌ２０与辅助受体结合、ｇ４１暴露并介导病毒包膜与细胞??
浓度和比例、细胞密度等各方面条件的影响［５１］，为了获得具有较高滴度的假病毒，??我们检测了包膜质粒与骨架质粒的比例分别为１：１、１：２、１：３和１：４时转染上清中??的ｐ２４含量。结果如图３所示，当两个质粒的比例为１：４时转染上清检测的０Ｄ值最??高，上清中ｐ２４含量最多，转染效率最高。此外，在转染时２９３Ｔ细胞汇合度达９０％??时转染效率较高。因此，后续实验我们采用包膜质粒与骨架质粒的比例为１：４，??并且当细胞汇合度达９０％时进行转染。??１．０－?￣￣??内丁??ｒ＋ｉ??Ｑ??０．５－??０．０?？?ｉ?■?Ｉ?■?ｉ?？?Ｉ?■?Ｉ??１：１?１：２?１：３?１：４??ｐＣＮＥ４９：ｐＮＬ４－３?Ｌｕｃ??图３不同质粒比例转染上清的ＯＤ值??１．２?ＨＩＶ－ｌｗ?感染?ＴＺＭ－ｂｌ?细胞??首先，我们采用不同稀释度的假病毒感染ＴＺＭ－ｂｌ细胞，但是感染后细胞中??荧光素酶活性较低，无法达到用于药物筛选的目的。因此，为了提高假病毒的感??２８??
?染性，经过查阅文献后，我们采用不同浓度ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液来促进病毒吸附。??结果如图４所示，ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的加入能够显著增加细胞中荧光素酶活性水??平，并且荧光素酶活性水平与ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的浓度呈剂量依赖关系。ＤＥＡＥ－??葡聚糖是一种阴离子交换剂，能够促进病毒吸附，为验证其是否会对细胞活性产??生影响，我们检测了ＤＥＡＥ＿葡聚糖溶液对ＴＺＭ－ｂｌ细胞的毒性作用。结果发现??ＤＥＡＥ－葡聚糖对ＴＺＭ－ｂ】细胞毒性较小，其ＣＣ５０值大于２００ｊｎｇ／ｍｌ。所以之后的研宄，??我们采用ＨＩＶ－ｌｗ感染ＴＺＭ－ｂｌ细胞，同时加入终浓度ｌＯｐｇ／ｍｌ的ＤＥＡＥ－葡聚糖溶??液促进病毒吸附。??Ａ?Ｌｕｄｆｅｒａｓｅ?Ｂ?Ｃｙｔｏｉｏｉｉｃｉｔｊ?ｏｆ?ＤＥＡＥ?ｏｎ?ＴＺＭ－ｂｌ??２４０００?－?■???？?？?ａｌ?１４０?－??—５３?Ｕｆ?ＯＬ????誦－?丄一口＾??ｇ??１Ｃ?ｔＪｊ．ｏＬ??雲科?ｉ：内?ｆ］?ｆｌ?ｆｌ?［１??８０００－?ｍ?＞?ＩＣＣ．．，》２００?叫．‘?｜??测ｗ：：??０?２０?４?０?６０?ＳＱ?１００?１２０?２００?４０?８?１－Ｓ?０３２?０．０６４?－??＊?毒置?Ｏｉｌ？孔）?Ｃｃｏｃｅｎｔｒ？ｊ〇ｎ（ｕｇ／ｍＬ）??图４?Ａ．?ＨＩＶ－ｌＬｕｔ感染ＴＺＭ－ｂ丨细胞后的荧光素酶活性；Ｂ．?ＤＥＡＥ－葡聚糖对ＴＺＭ－ｂ丨细胞??的毒性作用??１．３阳性药物对ＨＩＶ－Ｕｕｅ的抑制作用??为了验证ＨＩＶ－ｋＵ（：能否用于药物筛选以及ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液是否会对药物??对病毒的抑制作用产生影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗艾滋病药物新靶标及其小分子抑制剂的研究进展[J]. 霍志鹏,左晓芳,康东伟,展鹏,刘新泳. 药学学报. 2018(03)
[2]HIV-1核壳体蛋白NCp7抑制剂研究新进展[J]. 贾海永,俞霁,刘昕浩,张健,展鹏,刘新泳. 药学学报. 2017(11)
[3]分子对接在药物虚拟筛选中的应用进展[J]. 张煜卓,戚涵姝,谷笑雨,李天乐,刘丽艳,于湛. 广州化学. 2017(06)
[4]以gp120、CD4和CXCR4为靶点的HIV小分子进入抑制剂研究进展[J]. 陈冰霞,徐俊,马伟峰. 国际药学研究杂志. 2017(04)
[5]doraviring治疗艾滋病毒感染达到Ⅲ期临床试验主终点[J]. 黄世杰. 国际药学研究杂志. 2017(03)
[6]VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒筛选抗HIV-1药物的条件优化及应用[J]. 王萍,陈欢,罗荣华,卿晨,张高红,郑永唐. 中国药理学通报. 2016(03)
[7]HIV衣壳蛋白结构及其药物小分子研究进展[J]. 李俊,王巍. 药学学报. 2015(09)
[8]基于假病毒筛选抗病毒药物的研究进展[J]. 王萍,张高红,郑永唐. 国际药学研究杂志. 2015(03)
[9]抗HIV药物的最新研究进展[J]. 张兴权. 药学学报. 2015(05)
[10]HIV-Tat蛋白及其相关药物研究进展[J]. 邵锴,吴广谋,朱平,张国利. 中国实验诊断学. 2008(04)
硕士论文
[1]艾滋病抑制剂的计算机辅助药物研究[D]. 吴英纪.陕西科技大学 2017
[2]HIV-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究[D]. 王萍.昆明医科大学 2016
本文编号：3139953
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２?ｍｖ－ｉ的复制周期ｗ??ＨＩＶ－ｌ进入宿主细胞是一个包括病毒吸附、病毒包膜糖蛋白ｇｐｌ２０与细胞??表面ＣＤ４分子结合、ｌ２０与辅助受体结合、ｇ４１暴露并介导病毒包膜与细胞??
浓度和比例、细胞密度等各方面条件的影响［５１］，为了获得具有较高滴度的假病毒，??我们检测了包膜质粒与骨架质粒的比例分别为１：１、１：２、１：３和１：４时转染上清中??的ｐ２４含量。结果如图３所示，当两个质粒的比例为１：４时转染上清检测的０Ｄ值最??高，上清中ｐ２４含量最多，转染效率最高。此外，在转染时２９３Ｔ细胞汇合度达９０％??时转染效率较高。因此，后续实验我们采用包膜质粒与骨架质粒的比例为１：４，??并且当细胞汇合度达９０％时进行转染。??１．０－?￣￣??内丁??ｒ＋ｉ??Ｑ??０．５－??０．０?？?ｉ?■?Ｉ?■?ｉ?？?Ｉ?■?Ｉ??１：１?１：２?１：３?１：４??ｐＣＮＥ４９：ｐＮＬ４－３?Ｌｕｃ??图３不同质粒比例转染上清的ＯＤ值??１．２?ＨＩＶ－ｌｗ?感染?ＴＺＭ－ｂｌ?细胞??首先，我们采用不同稀释度的假病毒感染ＴＺＭ－ｂｌ细胞，但是感染后细胞中??荧光素酶活性较低，无法达到用于药物筛选的目的。因此，为了提高假病毒的感??２８??
?染性，经过查阅文献后，我们采用不同浓度ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液来促进病毒吸附。??结果如图４所示，ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的加入能够显著增加细胞中荧光素酶活性水??平，并且荧光素酶活性水平与ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液的浓度呈剂量依赖关系。ＤＥＡＥ－??葡聚糖是一种阴离子交换剂，能够促进病毒吸附，为验证其是否会对细胞活性产??生影响，我们检测了ＤＥＡＥ＿葡聚糖溶液对ＴＺＭ－ｂｌ细胞的毒性作用。结果发现??ＤＥＡＥ－葡聚糖对ＴＺＭ－ｂ】细胞毒性较小，其ＣＣ５０值大于２００ｊｎｇ／ｍｌ。所以之后的研宄，??我们采用ＨＩＶ－ｌｗ感染ＴＺＭ－ｂｌ细胞，同时加入终浓度ｌＯｐｇ／ｍｌ的ＤＥＡＥ－葡聚糖溶??液促进病毒吸附。??Ａ?Ｌｕｄｆｅｒａｓｅ?Ｂ?Ｃｙｔｏｉｏｉｉｃｉｔｊ?ｏｆ?ＤＥＡＥ?ｏｎ?ＴＺＭ－ｂｌ??２４０００?－?■???？?？?ａｌ?１４０?－??—５３?Ｕｆ?ＯＬ????誦－?丄一口＾??ｇ??１Ｃ?ｔＪｊ．ｏＬ??雲科?ｉ：内?ｆ］?ｆｌ?ｆｌ?［１??８０００－?ｍ?＞?ＩＣＣ．．，》２００?叫．‘?｜??测ｗ：：??０?２０?４?０?６０?ＳＱ?１００?１２０?２００?４０?８?１－Ｓ?０３２?０．０６４?－??＊?毒置?Ｏｉｌ？孔）?Ｃｃｏｃｅｎｔｒ？ｊ〇ｎ（ｕｇ／ｍＬ）??图４?Ａ．?ＨＩＶ－ｌＬｕｔ感染ＴＺＭ－ｂ丨细胞后的荧光素酶活性；Ｂ．?ＤＥＡＥ－葡聚糖对ＴＺＭ－ｂ丨细胞??的毒性作用??１．３阳性药物对ＨＩＶ－Ｕｕｅ的抑制作用??为了验证ＨＩＶ－ｋＵ（：能否用于药物筛选以及ＤＥＡＥ－葡聚糖溶液是否会对药物??对病毒的抑制作用产生影响
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗艾滋病药物新靶标及其小分子抑制剂的研究进展[J]. 霍志鹏,左晓芳,康东伟,展鹏,刘新泳. 药学学报. 2018(03)
[2]HIV-1核壳体蛋白NCp7抑制剂研究新进展[J]. 贾海永,俞霁,刘昕浩,张健,展鹏,刘新泳. 药学学报. 2017(11)
[3]分子对接在药物虚拟筛选中的应用进展[J]. 张煜卓,戚涵姝,谷笑雨,李天乐,刘丽艳,于湛. 广州化学. 2017(06)
[4]以gp120、CD4和CXCR4为靶点的HIV小分子进入抑制剂研究进展[J]. 陈冰霞,徐俊,马伟峰. 国际药学研究杂志. 2017(04)
[5]doraviring治疗艾滋病毒感染达到Ⅲ期临床试验主终点[J]. 黄世杰. 国际药学研究杂志. 2017(03)
[6]VSVG/HIV-1NL4-3Luc假病毒筛选抗HIV-1药物的条件优化及应用[J]. 王萍,陈欢,罗荣华,卿晨,张高红,郑永唐. 中国药理学通报. 2016(03)
[7]HIV衣壳蛋白结构及其药物小分子研究进展[J]. 李俊,王巍. 药学学报. 2015(09)
[8]基于假病毒筛选抗病毒药物的研究进展[J]. 王萍,张高红,郑永唐. 国际药学研究杂志. 2015(03)
[9]抗HIV药物的最新研究进展[J]. 张兴权. 药学学报. 2015(05)
[10]HIV-Tat蛋白及其相关药物研究进展[J]. 邵锴,吴广谋,朱平,张国利. 中国实验诊断学. 2008(04)
硕士论文
[1]艾滋病抑制剂的计算机辅助药物研究[D]. 吴英纪.陕西科技大学 2017
[2]HIV-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究[D]. 王萍.昆明医科大学 2016
本文编号：3139953
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