DAXX对于VSMC增殖的影响及机制研究

发布时间：2017-04-20 04:02

  本文关键词：DAXX对于VSMC增殖的影响及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:证实DAXX可以通过PTEN/AKT信号通路,抑制VSMC增殖,为动脉粥样硬化性的血管病变提供新的理论依据。方法:将DAXX的过表达质粒pc DNA3.1(+)-DAXX及DAXX的干扰质粒si RNA-DAXX,稳定转染至体外培养的VSMC中,RT-PCR、Western Blot检测转染效率;MTT检测细胞活力;流式细胞术检测VSMC周期情况;构建PTEN干扰质粒si RNA-PTEN,瞬时转染到DAXX稳转细胞株,应用Western Blot检测细胞内PTEN、AKT、P-AKT蛋白表达情况,RT-PCR检测转染后细胞内PTEN m RNA表达情况。结果:RT-PCR、Western Blot结果显示,与模型组比较,转染pc DNA3.1(+)-DAXX组,DAXX表达明显升高;而si RNA-DAXX转染组,DAXX表达明显降低,具有统计学差异,表明转染效率达到实验要求。MTT结果显示,与正常对照组比较,模型组细胞活性明显升高,与模型组比较,转染pc DNA3.1(+)-DAXX组,细胞增殖明显受到抑制;而si RNA-DAXX组的细胞活性相对升高,细胞增殖明显。流式细胞术检测发现,与正常对照组比较,模型组S期细胞明显增多,与模型组比较,转染pc DNA3.1(+)-DAXX组,S期细胞含量明显下降;而转si-DAXX组呈现相反的趋势。RT-PCR结果显示,转染pc DNA3.1(+)-DAXX组PTEN表达与模型组相比明显升高,而si RNA-DAXX组的PTEN表达低于模型组;pc DNA3.1(+)-DAXX稳转细胞株瞬时转染si RNA-PTEN后,PTEN表达较模型组明显降低。Western Blot检测结果显示转pc DNA3.1(+)-DAXX组,PTEN蛋白表达明显高于模型组,P-AKT表达降低;而转si RNA-DAXX组,PTEN蛋白表达却显著低于模型组,P-AKT表达增加;pc DNA3.1(+)-DAXX稳转细胞株瞬时转染si RNA-PTEN后,PTEN蛋白表达较模型组明显降低,而p-AKT表达明显增高。结论:DAXX可以明显抑制10%FBS刺激的VSMC增殖;DAXX抑制VSMC增殖,可能与PTEN/AKT这条信号通路有关。
【关键词】：DAXX VSMC PTEN AKT 细胞增殖
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-14
• 第2章 稳定转染细胞株构建14-30
• 2.1 引言14-15
• 2.2 主要仪器与材料15-17
• 2.2.1 仪器15-16
• 2.2.2 主要试剂16-17
• 2.3 实验方法17-19
• 2.3.1 主要溶液配制17-18
• 2.3.2 质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1(+)-DAXX、siRNA-DAXX、siRNA、siRNA-PTEN的扩增与提取18-19
• 2.4 VSMC培养与转染19-20
• 2.4.1 细胞培养19
• 2.4.2 稳定转染VSMC19-20
• 2.5 RT-PCR检测稳定转染细胞株内DAXX mRNA变化20-22
• 2.5.1 总RNA的提取20-21
• 2.5.2 RNA逆转录（cDNA的合成）21-22
• 2.5.3 PCR扩增：22
• 2.5.4 PCR产物鉴定22
• 2.6 Western-blot 检测 DAXX 蛋白的表达22-26
• 2.6.1 VSMC蛋白提取22-23
• 2.6.2 蛋白含量测定23
• 2.6.3 进行Western-blot实验23-26
• 2.7 统计学方法26
• 2.8 实验结果26-28
• 2.8.1 稳定转染pcDNA3.1(+)-DAXX、siRNA-DAXX对VSMC内DAXX的mRNA、蛋白表达的影响26-28
• 2.9 小结28-30
• 第3章 DAXX对于VSMC增殖的影响30-36
• 3.1 引言30
• 3.2 仪器与材料30
• 3.3 实验方法30-32
• 3.3.1 主要溶液配制30-31
• 3.3.2 MTT检测细胞的活力31
• 3.3.3 流式细胞术检测细胞周期31-32
• 3.4 结果32-34
• 3.4.1 MTT检测DAXX对于VSMC增殖的影响32
• 3.4.2 DAXX对于VSMC周期的影响32-34
• 3.5 小结34-36
• 第4章 DAXX对于PTEN/AKT信号通路的影响36-50
• 4.1 DAXX对于PTEN表达的影响36-42
• 4.1.1 引言36
• 4.1.2 仪器与材料36-37
• 4.1.3 实验方法37-39
• 4.1.4 结果39-41
• 4.1.5 小结41-42
• 4.2 DAXX对于AKT表达的影响42-50
• 4.2.1 引言42
• 4.2.2 实验方法42-43
• 4.2.3 结果43-47
• 4.2.4 小结47-50
• 第5章 实验讨论50-52
• 第6章 结论52-54
• 参考文献54-58
• 综述58-68
• 参考文献65-68
• 作者攻读学位期间的科研成果68-69
• 致谢69

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