microRNA-24对内皮型一氧化氮合酶表达调节及血管内皮细胞增殖的影响及相关机制研究

发布时间：2017-04-20 03:17

  本文关键词：microRNA-24对内皮型一氧化氮合酶表达调节及血管内皮细胞增殖的影响及相关机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的为进一步探讨miRNA-24是否参与eNOS表达的调控及其对血管内皮细胞增殖的影响,本研究构建miRNA-24高表达质粒,并用脂质体将其导入人类脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs),观察miRNA-24对eNOS表达及HUVECs增殖的影响并探讨其相关分子机制。方法1.miRNA-24对HUVECs增殖影响。用脂质体LipofectamineTM 2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中,4h后更换含10%胎牛血清的1640培养基继续培养。在12h,24h,48 h,72 h四个时间点用细胞计数法计数细胞增殖数量；MTT检测细胞增殖情况；细胞划痕法检测细胞迁移情况；Griess法检测培养上清的NO含量。2.miRNA-24对eNOS表达的影响用脂质体LipofectamineTM 2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中,4h后更换含10%胎牛血清的1640培养基继续培养24h。实时荧光定量PCR检测eNOS的mRNA表达情况；免疫组织化学法和Western blot法检测eNOS蛋白质表达水平。3.miRNA-24对SP-1表达的影响用脂质体LipofectamineTM 2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中,4h后更换含10%胎牛血清的1640培养基继续培养24h。荧光定量PCR检测SP-1的mRNA表达情况；免疫组织化学法检测SP-1蛋白质表达情况；Western blot法检测SP-1蛋白质表达水平。4.证实eNOS和SP-1是miRNA-24的靶基因生物信息学结果显示,miR-24通过与eNOS和Sp-1的3'-UTR结合参与其表达的调控,我们分别构建了包含eNOS-3'UTR和SP-1-3'UTR区野生型、突变型序列的荧光素酶报告系统(pMIR-Report)并分别命名为pGL3-eNOS-wt, pGL3-eNOS-mut, pGL3-Sp1-wt, pGL3-Sp1-mut,将HUVECs种于24孔板中,用脂质体作为载体将报告质粒和荧光素酶报告系统(海肾荧光素酶和miR-24或空白质粒)一同转染4小时。荧光酶素的活性由双荧光素酶报告分析系统检测。结果1.与对照组比较,miRNA-24高表达组细胞数目减少(P0.01),增殖和迁移速度减慢(P0.05),NO释放也明显减少(P0.01)。2.与对照组比较,miRNA-24高表达组eNOS的mRNA和蛋白表达明显减少(P0.05)。3.与对照组比较,miRNA-24高表达组SP-1的mRNA和蛋白表达明显减少(P0.05)。4.与突变型报告质粒相比较,野生型荧光酶素报告质粒pGL3-eNOS-wt和pGL3-Sp-1-wt共转染时miRNA-24可以显著降低其活性(P0.01)结论1.高表达miRNA-24可以抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖,减少细胞数量,减少人类脐静脉内皮细胞NO的合成。2.miRNA-24抑制]HUVECs中eNOS的mRNA和蛋白质表达,eNOS是HUVECs中miRNA-24的靶基因。3.miRNA-24抑制HUVECs中SP-1的mRNA和蛋白质表达,SP-1是HUVECs中miRNA-24的靶基因。4.miRNA-24可存转录后水平通过影响细胞因子SP-1间接调控eNOS在HUVECs的表达。
【关键词】：miRNA-24 HUVECs 细胞增殖 eNOS NO SP-1
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 主要中英文缩略写6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-19
• 参考文献16-19
• 第一部分 miR-24对HUVECs增殖的影响19-35
• 实验材料19-21
• 实验方法21-26
• 结果26-30
• 讨论30-32
• 小结32-33
• 参考文献33-35
• 第二部分 miR-24对内皮型一氧化氮合酶表达的影响及相关分子机制35-56
• 实验材料35-37
• 实验方法37-42
• 结果42-50
• 讨论50-53
• 小结53-54
• 参考文献54-56
• 全文总结56-59
• 综述59-72
• 参考文献68-72
• 致谢72-73
• 攻读硕士学位期间发表的论文73-75
• 攻读硕士学位期间参加科研项目75

【参考文献】

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1 严丽梅;吴建勇;于潇华;徐竞鸥;欧和生;;内含子源性microRNA对内皮型一氧化氮合酶表达及血管内皮细胞增殖的作用[J];生物化学与生物物理进展;2010年07期

  本文关键词：microRNA-24对内皮型一氧化氮合酶表达调节及血管内皮细胞增殖的影响及相关机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：317798