ApoE修饰阳离子脂质体的制备及其功能的初步研究

发布时间：2017-04-23 04:01

  本文关键词：ApoE修饰阳离子脂质体的制备及其功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:1.自制普通阳离子脂质体。2.将普通阳离子脂质体与apo E(载脂蛋白E)偶联,构建一种新型的具有与肝(癌)细胞结合特异性的转染载体,即apo E修饰脂质体。3.分别检测自制普通阳离子脂质体和apo E修饰脂质体对人正常肝细胞株HL-7702和人肝癌细胞株HepG2、HuH-7和Li-7的转染特异性和转染效率。4.探索不同apo E含量的apo E修饰脂质体对三种肝癌细胞的转染效率,并探索apo E修饰脂质体的储备时间是否对细胞转染有影响。5.检测自制普通阳离子脂质体与apoE修饰脂质体对HepG2细胞是否具有细胞毒性作用。研究方法:1.乙醇注入法和挤压法联合制备普通阳离子脂质体。2.将载脂蛋白E与普通阳离子脂质体偶联,制备apoE修饰脂质体。3.将普通阳离子脂质体和apoE修饰脂质体分别与pGenesil-1质粒混匀、孵育,确定最佳的转染比例。4.分别使用普通阳离子脂质体和apo E修饰脂质体转染细胞,荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白EGFP的表达以检测apoE修饰脂质体对HL-7702正常肝细胞、HepG2、HuH-7和Li-7肝癌细胞的转染特异性。5.制备不同apoE含量的apo E修饰脂质体,分别转染HepG2、HuH-7肝癌细胞,荧光显微镜和流式细胞术筛选转染率最高的apoE修饰脂质体,确定脂质体中apoE的最佳负载量。6.储备时间不同的apo E修饰脂质体分别转染HepG2肝癌细胞,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,统计学分析apoE修饰脂质体的储备时间是否对细胞转染有影响。7.琼脂糖凝胶电泳分析apoe修饰脂质体-质粒dna复合物与普通阳离子脂质体-质粒dna复合物在dnaseⅠ溶液中的稳定性。8.脂质体对hepg2肝癌细胞的毒性实验,通过mtt法研究普通阳离子脂质体和apoe修饰脂质体对hepg2的细胞毒性作用。研究结果:1.普通阳离子脂质体制备完成后,使用pgenesil-1质粒进行包裹实验,确定普通阳离子脂质体:pgenesil-1质粒的最佳结合比例为0.5μl:2.5μg。2.apoe修饰脂质体制备完成后,使用pgenesil-1质粒进行包裹实验,确定apoe修饰脂质体:pgenesil-1质粒的最佳结合比例为2μl:2.5μg。3.两种脂质体介导pgenesil-1质粒转染三种肝癌细胞、正常肝细胞和其他肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察,证实apoe修饰脂质体对三种肝癌细胞和正常肝细胞具有结合特异性。4.流式细胞术结果表明,当apoe负载量为6.6μg/ml时,转染率最高,差异具有统计学意义(p0.05)。5.流式细胞术证实,随着apoe修饰脂质体储备时间的增长,其对hepg2肝癌细胞的转染率下降,差异具有统计学意义(p0.05)。6.mtt实验未观察到两种脂质体对hepg2细胞有明显的毒性作用(p0.05)。研究结论:1.apoe修饰脂质体较普通阳离子脂质体具有更高的转染效率,apoe修饰脂质体中apoe的负载量不同,细胞转染效率也不同。2.随着apoe修饰脂质体储备时间的增长,apoe修饰脂质体的转染效率呈下降趋势。3.未观察到apoe修饰脂质体和普通阳离子脂质体对hepg2细胞的明显毒性作用。
【关键词】：载脂蛋白E 肝细胞 肝癌细胞 普通阳离子脂质体 apo E修饰脂质体
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-14
• 前言14-16
• 1 实验材料16-22
• 1.1 细胞株16
• 1.2 菌株16
• 1.3 质粒16
• 1.4 主要试剂16-18
• 1.5 主要实验器材和仪器18-19
• 1.6 试剂的配制19-22
• 2 实验方法22-30
• 2.1 质粒的转化22
• 2.2 细菌的扩大培养22
• 2.3 质粒DNA的提取22-23
• 2.4 质粒DNA浓度的测定23
• 2.5 菌液的保存23
• 2.6 细胞培养23-24
• 2.7 载脂蛋白apo E修饰脂质体的构建24-25
• 2.8 脂质体包裹质粒实验25
• 2.9 细胞转染25-26
• 2.10 转染效率的测定26
• 2.11 Apo E修饰脂质体特异性的鉴定26-27
• 2.12 Apo E修饰脂质体中apoE最佳负载量的筛选27
• 2.13 Apo E修饰脂质体储备时间对细胞转染效率的影响27
• 2.14 SDS破裂脂质体-DNA复合物实验27
• 2.15 脂质体-DNA复合物在DNaseⅠ中的稳定性27-28
• 2.16 脂质体对HepG2细胞的毒性检测28-30
• 3 实验结果30-48
• 3.1 细胞培养30-31
• 3.2 质粒图谱31
• 3.3 脂质体包裹质粒DNA实验31-32
• 3.4 Apo E修饰脂质体转染特异性实验32-36
• 3.5 Apo E修饰脂质体中apoE最佳负载量的筛选36-41
• 3.6 Apo E修饰脂质体储备时间对转染效率的影响41-43
• 3.7 SDS对apoE修饰脂质体-DNA复合物的裂解43-44
• 3.8 Apo E修饰脂质体-DNA复合物在DNaseⅠ消化液中的稳定性44-45
• 3.9 脂质体对HepG2细胞的毒性检测45-48
• 4 讨论48-50
• 5 结论50-51
• 参考文献51-53
• 综述53-62
• 参考文献59-62
• 致谢62-63
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果63-64
• 个人简历64

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本文编号：321757