Temporin-1CEb改造肽对LPS诱导炎症反应的影响及其作用机制的研究

发布时间：2017-04-24 19:08

  本文关键词：Temporin-1CEb改造肽对LPS诱导炎症反应的影响及其作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,又称内毒素,是诱发炎症反应的主要原因,过度的炎症反应会使生物体患脓毒症等疾病,甚至会导致生物体死亡。抗菌肽是生物体先天性免疫系统的重要组成成分,具有分子量小、理化性质稳定、对哺乳动物没有毒性、广谱的杀菌活性、自身不易引发耐药性及抗炎等特性。本实验室前期研究发现:temporin-1CEb四种改造肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2具有很好的杀菌活性及溶血性低等特性。四种抗菌肽分别带5-6个净正电荷,可以与带负电荷的LPS结合。所以本论文以人单核细胞U937为研究模型,探究四种抗菌肽对LPS介导的炎症反应的影响及其作用机制。四种抗菌肽对U937细胞毒性实验结果表明,L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2对U937细胞的毒性很小。当抗菌肽在低浓度时,基本对细胞无毒性;当抗菌肽在高浓度时,L-K5,L-K6V1,L-K6V2对细胞的毒性不大,细胞的存活率仍然达到85%左右,杀伤力最强的L-K6处理的细胞存活率也能达到70%。说明这四种抗菌肽都能作为抗炎的实验材料。LPS侵入生物体内后,可以激活免疫细胞,诱使其释放炎症因子,如TNF-α、IL-8、NO等,进而引发炎症。我们的实验结果显示抗菌肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2能够明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-8、NO的释放。即使在低浓度20μM时,四种抗菌肽也能很好的抑制TNF-α、IL-8、NO的释放,其中,L-K6的抑制能力最强。综上可见,四种抗菌肽都有抑制LPS诱导炎症反应的能力。圆二色谱(CD)和等温滴定量热仪(ITC)测定四种抗菌肽与LPS的结合能力。CD实验结果显示四种抗菌肽在SP缓冲溶液中均呈无规则卷曲结构,但在LPS溶液中,四种抗菌肽的二级结构呈现规则的α-螺旋结构,说明LPS可以诱导抗菌肽形成规则结构;ITC实验表明抗菌肽的正电荷可以通过静电作用与LPS的负电荷结合,其中L-K6和L-K6V1与LPS的结合能力强于L-K5和L-K6V2与LPS的结合能力。四种抗菌肽都能使LPS聚集体解聚,L-K6处理后,直径在6000nm大小的LPS全部消失,L-K5解聚程度相对较弱。四种抗菌肽都能很好的抑制LPS与细胞结合,其中L-K6的抑制能力最强,L-K5的抑制能力相对较弱。细胞流式实验也证明四种抗菌肽通过与CD14的相互作用,直接抑制了LPS与细胞炎症信号传导通路受体CD14的结合,L-K6和L-K6V1的抑制效果强于L-K6V2和L-K5。RT-qPCR检测抗菌肽对MyD88、IκK、NFκB表达的影响。实验结果表明:抗菌肽能够不同程度的抑制MyD88、IκK、NFκB的表达,其中L-K6的抑制能力最强。
【关键词】：抗菌肽 脂多糖(LPS) 炎症
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-11
• 1 文献综述11-20
• 1.1 炎症与脓毒症的研究进展11-12
• 1.2 LPS诱导炎症反应的研究进展12-16
• 1.2.1 LPS的来源及其结构特点12-13
• 1.2.2 LPS的功能特点13
• 1.2.3 LPS引起炎症反应的作用机制13-15
• 1.2.4 与LPS引起的炎症反应有关的通路蛋白及炎症因子15-16
• 1.3 抗菌肽的来源及其结构特点16-17
• 1.4 抗菌肽的作用特点17
• 1.5 抗菌肽在先天性免疫中的作用17-20
• 1.5.1 适当性的表达可增强宿主抗感染的能力18
• 1.5.2 充当免疫细胞的趋化因子18
• 1.5.3 抗菌肽对炎症关键性启动因子LPS的调节作用18-20
• 2. 抗菌肽对U937细胞毒性及其对LPS诱导炎症的影响20-28
• 2.1 实验材料20
• 2.1.1 实验材料及试剂20
• 2.1.2 实验仪器20
• 2.2 实验方法20-22
• 2.2.1 细胞培养20
• 2.2.2 MTT检测抗菌肽对U937细胞毒性试验20-21
• 2.2.3 TNF-α 含量的测定21
• 2.2.4 IL-8 含量的测定21-22
• 2.2.5 NO含量的测定22
• 2.2.6 统计分析22
• 2.3 结果22-26
• 2.3.1 抗菌肽对U937细胞毒性作用22-23
• 2.3.2 抗菌肽对LPS诱导的U937细胞TNF-α 的影响23-24
• 2.3.3 抗菌肽对LPS诱导U937细胞IL-8 的影响24-25
• 2.3.4 抗菌肽对LPS诱导U937细胞NO的影响25-26
• 2.4 讨论26-28
• 3 抗菌肽抑制LPS诱导炎症的机制28-42
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 材料及试剂28
• 3.1.2 实验仪器28-29
• 3.2 实验方法29-31
• 3.2.1 圆二色谱法测定抗菌肽的二级结构29
• 3.2.2 ITC检测抗菌肽与LPS结合29
• 3.2.3 抗菌肽解离LPS聚体29
• 3.2.4 动态光散射（DLS）29-30
• 3.2.5 抗菌肽抑制LPS与U937细胞结合30
• 3.2.6 细胞流式检测抗菌肽对LPS与U937细胞结合的影响30
• 3.2.7 细胞膜CD14测定30
• 3.2.8 细胞总RNA的提取30-31
• 3.2.9 实时荧光定量PCR31
• 3.3 实验结果31-40
• 3.3.1 抗菌肽的二级结构31-32
• 3.3.2 抗菌肽结合LPS32-34
• 3.3.3 抗菌肽解聚LPS聚体34-36
• 3.3.4 抗菌肽抑制LPS与细胞结合能力检测36-37
• 3.3.5 抗菌肽与CD14结合能力的测定37-38
• 3.3.6 抗菌肽对MyD88/IκB/NFκB通路蛋白表达的影响38-40
• 3.4 讨论40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-47
• 附录A β-acton、MyD88、IκB-α、NFκB的溶解曲线和扩增曲线47-51
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况51-52
• 致谢52

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本文编号：324796