2D/3D HepaRG细胞模型的建立及在体外肝毒性研究中的应用
发布时间：2021-07-22 16:08
方法:本研究首先以HepG2和HepaRG两种细胞作为研究对象,主要从酶学指标、蛋白表达及尿素分泌水平进行综合评估,从而优选出更合适的细胞构建2D及3D聚球体模型。通过RT-PCR检测手段研究2D及3D模型在基因层面的表达差异,免疫荧光检测及Westen blot技术研究2D/3D模型在蛋白层面的差异;在毒性实验方面,采用阴性药物阿司匹林（Aspirin,ASP）和阳性药物对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）对两个模型进行初步验证,证明该模型可以预测药物肝毒性;然后选用具有胆汁淤积风险的阳性药曲格列酮（Troglitazone,TRO）、奈法唑酮（Nefazodone,NEF）、托卡朋（Tolcapone,Tol）、异烟肼（Isoniazid,ISO）、氯丙嗪（Chlorpromazine,CPZ）、盐酸氟西汀（Fluoxetine hydrochride,FLX）、帕罗西汀（Paroxetine,PAR）、马来酸三甲丙咪嗪（Trimipramine Maleate,TRM）、盐酸度洛西汀（Duloxetine hydrochloride,DUX）以及阴性药物叶酸（Fo...
【文章来源】：聊城大学山东省
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HepG2 和 HepaRG 细胞形态及直径
2.3.2 HepG2 和 HepaRG 细胞 HE 染色实验HepG2 和 HepaRG 细胞在 2D 环境中均选择对数生长阶段的细胞进行染色，3D条件下以连续培养 10 天和 14 天的 HepaRG 细胞作为研究对象，进行 HE 染色，因为此阶段的 HepaRG 细胞已经分化成熟。HE 染色结果见图 2-2。2D 培养条件下，HepG2细胞呈独立生长，HepaRG 细胞间接触相对较好，明显优于 HepG2 细胞，这有利于细胞更充分的物质交流及信息传递；另外，在 2D 培养中 HepG2 及 HepaRG 细胞均呈现出良好的细胞内结构，且生长状态良好，见图 2-2A；3D 聚球体模型中，在第 10天，HepaRG 细胞间内部结构接触较为致密，细胞生长有序，无明显坏死和供能障碍；对于连续培养 14 天的 HepaRG 聚球体模型，内部细胞出现水肿、核碎裂及缺氧等功能障碍，说明随着培养时间的延长及细胞体积不断增大细胞由于供氧严重不足及营养物质传递不通畅已经濒临崩解，这不利于细胞继续培养以及进行后续实验，见图2-2B。因此，最终决定选用培养 10 天的细胞进行药物毒性检测。A
聊城大学硕士学位论文HepaRG 细胞中白蛋白的分泌量约为 HepG2 细胞的 4.36 倍，由此可得出结论：无何种培养条件，HepaRG 细胞中 ALB 生成水平均明显优于 HepG2，是更理想的细模型，如图 2-4(A)。免疫荧光染色实验发现，HepG2 和 HepaRG 两种细胞中的 ALB 在 2D 及 3D养条件下均显示出明显表达，且 HepaRG 细胞中的 ALB 生成较 HepG2 上升明显如图 2-4 B；此外，通过 WB 条带分析也可得出同样的结论，且 3D 聚球体模型要于 2D 传统培养方式，如图 2-4 C。综上所述，就模型建立而言，HepG2 及 HepaRG 细胞中 ALB 合成能力在 3D养环境下明显优于 2D 传统培养方式；另外，就细胞而言，相同培养条件下 HepR细胞中白蛋白的产量要明显高于 HepG2 细胞。所以，HepaRG 是更合适的体外细模型系统。
【参考文献】：
期刊论文
[1]体外肝细胞三明治培养动态变化及其在药源性肝损伤中的应用[J]. 黄珊,孙丽新,江振洲,张陆勇. 中国临床药理学与治疗学. 2016(03)
[2]体外构建三维肝肿瘤模型及药物筛选[J]. 刘劲松. 中国组织工程研究. 2014(27)
[3]毒理学研究中的体外细胞毒性评价[J]. 刘涛,郭辰,赵晓红. 生命科学. 2014(03)
[4]以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统[J]. 王敏,兰亚,胡皓,时永全,韩英,周新民. 中国组织工程研究. 2013(29)
[5]抗精神病药所致肝内胆汁淤积症的治疗进展[J]. 周芳珍. 医学理论与实践. 2013(03)
[6]胆汁的分泌、排泄和调节及胆汁淤积发生机制[J]. 陆伦根. 临床肝胆病杂志. 2011(06)
[7]HepaRG细胞的生物学特点及其应用[J]. 蒋黎,王宇明. 肝脏. 2010(05)
[8]血清前白蛋白检测在慢性肝病中的临床意义[J]. 杜文胜,邱隆敏,鄢仁晴. 遵义医学院学报. 2010(02)
[9]Hepatospheres:Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver[J]. Franziska van Zijl,Wolfgang Mikulits. World Journal of Hepatology. 2010(01)
[10]肝细胞体外培养技术的研究与进展[J]. 陈杰,彭承宏,沈柏用,邓侠兴,韩宝三,李宏为. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(53)
博士论文
[1]白蛋白结合功能在肝脏损伤及肝脏切除患者中的变化[D]. 葛鹏磊.北京协和医学院 2016
硕士论文
[1]3D肝毒性评价模型的建立及何首乌肝毒性机制的初步探索[D]. 李丹丹.广西医科大学 2016
[2]2D、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞在药物肝毒性评价中的比较研究[D]. 李曼.广东药科大学 2016
本文编号：3297463
【文章来源】：聊城大学山东省
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HepG2 和 HepaRG 细胞形态及直径
2.3.2 HepG2 和 HepaRG 细胞 HE 染色实验HepG2 和 HepaRG 细胞在 2D 环境中均选择对数生长阶段的细胞进行染色，3D条件下以连续培养 10 天和 14 天的 HepaRG 细胞作为研究对象，进行 HE 染色，因为此阶段的 HepaRG 细胞已经分化成熟。HE 染色结果见图 2-2。2D 培养条件下，HepG2细胞呈独立生长，HepaRG 细胞间接触相对较好，明显优于 HepG2 细胞，这有利于细胞更充分的物质交流及信息传递；另外，在 2D 培养中 HepG2 及 HepaRG 细胞均呈现出良好的细胞内结构，且生长状态良好，见图 2-2A；3D 聚球体模型中，在第 10天，HepaRG 细胞间内部结构接触较为致密，细胞生长有序，无明显坏死和供能障碍；对于连续培养 14 天的 HepaRG 聚球体模型，内部细胞出现水肿、核碎裂及缺氧等功能障碍，说明随着培养时间的延长及细胞体积不断增大细胞由于供氧严重不足及营养物质传递不通畅已经濒临崩解，这不利于细胞继续培养以及进行后续实验，见图2-2B。因此，最终决定选用培养 10 天的细胞进行药物毒性检测。A
聊城大学硕士学位论文HepaRG 细胞中白蛋白的分泌量约为 HepG2 细胞的 4.36 倍，由此可得出结论：无何种培养条件，HepaRG 细胞中 ALB 生成水平均明显优于 HepG2，是更理想的细模型，如图 2-4(A)。免疫荧光染色实验发现，HepG2 和 HepaRG 两种细胞中的 ALB 在 2D 及 3D养条件下均显示出明显表达，且 HepaRG 细胞中的 ALB 生成较 HepG2 上升明显如图 2-4 B；此外，通过 WB 条带分析也可得出同样的结论，且 3D 聚球体模型要于 2D 传统培养方式，如图 2-4 C。综上所述，就模型建立而言，HepG2 及 HepaRG 细胞中 ALB 合成能力在 3D养环境下明显优于 2D 传统培养方式；另外，就细胞而言，相同培养条件下 HepR细胞中白蛋白的产量要明显高于 HepG2 细胞。所以，HepaRG 是更合适的体外细模型系统。
【参考文献】：
期刊论文
[1]体外肝细胞三明治培养动态变化及其在药源性肝损伤中的应用[J]. 黄珊,孙丽新,江振洲,张陆勇. 中国临床药理学与治疗学. 2016(03)
[2]体外构建三维肝肿瘤模型及药物筛选[J]. 刘劲松. 中国组织工程研究. 2014(27)
[3]毒理学研究中的体外细胞毒性评价[J]. 刘涛,郭辰,赵晓红. 生命科学. 2014(03)
[4]以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统[J]. 王敏,兰亚,胡皓,时永全,韩英,周新民. 中国组织工程研究. 2013(29)
[5]抗精神病药所致肝内胆汁淤积症的治疗进展[J]. 周芳珍. 医学理论与实践. 2013(03)
[6]胆汁的分泌、排泄和调节及胆汁淤积发生机制[J]. 陆伦根. 临床肝胆病杂志. 2011(06)
[7]HepaRG细胞的生物学特点及其应用[J]. 蒋黎,王宇明. 肝脏. 2010(05)
[8]血清前白蛋白检测在慢性肝病中的临床意义[J]. 杜文胜,邱隆敏,鄢仁晴. 遵义医学院学报. 2010(02)
[9]Hepatospheres:Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver[J]. Franziska van Zijl,Wolfgang Mikulits. World Journal of Hepatology. 2010(01)
[10]肝细胞体外培养技术的研究与进展[J]. 陈杰,彭承宏,沈柏用,邓侠兴,韩宝三,李宏为. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(53)
博士论文
[1]白蛋白结合功能在肝脏损伤及肝脏切除患者中的变化[D]. 葛鹏磊.北京协和医学院 2016
硕士论文
[1]3D肝毒性评价模型的建立及何首乌肝毒性机制的初步探索[D]. 李丹丹.广西医科大学 2016
[2]2D、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞在药物肝毒性评价中的比较研究[D]. 李曼.广东药科大学 2016
本文编号：3297463
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