基于CaCC的TRPV4调节剂高通量筛选细胞模型的建立

发布时间：2021-07-23 13:36

　　目的构建基于钙激活氯离子通道（CaCC）的瞬时受体电位香草酸亚型4（TRPV4）调节剂的高通量筛选细胞模型。方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮（FRT）细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况。应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1（ANO1）和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性。加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca²⁺浓度;通过Z’因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选。结果 RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4。倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达AN... 

【文章来源】：解放军医学杂志. 2020,45(10)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

基于CaCC靶向TRPV4的细胞筛选模型构建原理

在加入不同浓度的TRPV4激活剂和抑制剂后,荧光信号呈现不同的变化。激活剂和抑制剂的浓度与荧光Slope值呈现剂量-效应依赖关系。采用GraphPad Prism 8.0软件进行非线性曲线拟合分析,浓度取对数作图,得到浓度效应曲线:GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747的EC50分别为9.17、50.06、147.50 μmol/L(图6A),GSK2193874、HC-067047、RN-1734的IC50分别为5.74、10.91、72.49 μmol/L(图6B)。该结果表明激活剂和抑制剂对TRPV4通道的作用具有浓度依赖性,证实了该模型可用于TRPV4调节剂的筛选。图6 TRPV4激活剂及抑制剂的剂量依赖曲线(n=3)

将TRPV4条带的切胶回收产物送生工生物工程股份有限公司测序,测序结果在Chromas软件上进行分析,峰图结果如图1C所示,无重叠峰,其中竖线位置为内含子。所测核苷酸序列采用美国生物技术信息中心(national center for biotechnology informatio,NCBI)的序列比对工具(basic local alignment search tool,BLAST)进行比对,结果显示其与GenBank数据库收录的TRPV4基因序列相似性为100%,表明所克隆的DNA片段即为目的基因片段,FRT细胞在mRNA水平上内源性表达TRPV4(图1D)。2.2 FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况

【参考文献】：
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本文编号：3299391