沙利度胺对组胺诱导后的人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、端粒酶mRNA的影响

发布时间：2017-04-30 03:17

  本文关键词：沙利度胺对组胺诱导后的人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、端粒酶mRNA的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:成纤维细胞的异常增生或胶原蛋白的代谢失衡是病理性瘢痕和纤维化疾病致病原因之一[1]。端粒对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用,端粒酶能通过延长缩短的端粒来增强体外细胞的增殖能力。端粒酶催化亚单位TERT是其关键的限速酶[2]。目前已有研究证明瘢痕疙瘩中成纤维细胞端粒酶活性明显增高[3]。近年来,沙利度胺在治疗纤维化性皮肤病及人类其他脏器的纤维化疾病的相关报道越来越多,国内外已有研究证实沙利度胺对纤维化性皮肤病及其他脏器的纤维化疾病均有抑制作用[4-5]。在沙利度胺和端粒酶作用的相关研究中,有结果显示沙利度胺可通过下调h TERTm RNA转录水平,抑制端粒酶活性来诱导多发性骨髓瘤U266细胞凋亡、抑制细胞增殖[6]。组胺作为皮肤纤维化疾病活化刺激因素之一,它可促进成纤维细胞生长、增殖及促进胶原蛋白合成[7],与病理性瘢痕的形成关系密切[8]。目前,关于沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞增殖及胶原的表达的直接影响尚无报道;关于沙利度胺对经组胺刺激活化后成纤维细胞增殖活性、I、III型胶原蛋白及端粒酶的直接影响也未见报道。因此,本研究检测,经组胺刺激后,活化增生的成纤维细胞在沙利度胺干预后,对其增殖活性、端粒酶活性及I、III型胶原蛋白m RNA的直接作用,以探讨沙利度胺在抑制活化后的成纤维细胞的增殖、降低其端粒酶活性及胶原表达方面的直接作用,从而研究沙利度胺在抗真皮纤维化的潜在作用,为防止术后瘢痕形成及对病理性瘢痕的临床治疗和预后提供新的指导思路。目的:探索沙利度胺对组胺诱导后的成纤维细胞增殖及I、III型胶原蛋白、端粒酶活性的m RNA表达的直接影响。方法:1正常真皮成纤维细胞原代培养,并经波形蛋白免疫组化染色,行细胞鉴定,取第4代细胞进行试验。2 CCK-8测正常成纤维细胞增殖活性:细胞消化后接种于96孔培养板中,每组均设置5个重复孔,各组分别中加入含有浓度分别为0(空白对照组)、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L含沙利度胺的DMEM培养基,用CCK-8法检测沙利度胺作用24h后细胞在560nm处的光密度值(OD值),对结果进行统计学分析。3实验分组及CCK-8测经组胺刺激后的成纤维细胞增殖活性实验分为空白对照组(K组)、沙利度胺处理组(S组)、组胺处理组(Z组)、组胺+沙利度胺处理组(Z+S组)。取成纤维细胞单细胞悬液,浓度为2×104/ml,每孔200ul接种于96孔板,Z组及Z+S组分别加入200ul 100UM的组胺工作液,K组及S组加等量空白培养液,共同培养48小时。弃去各组培养液,S组及Z+S组更换10-5mol/L沙利度胺液,其余两组加入等量DMEM.每组设5个复孔,继续培养24小时。采用上述CCK-8法测得OD值,并对以上数值进行统计学分析。4采用SYBR Green I染料法荧光定量PCR测定COL-I、COL-IIIm RNA的表达情况及统计学分析按上述分组要求处理细胞,每组设三个样本,均接种在25m L培养瓶中继续培养。24h后提取各组总RNA。应用荧光定量PCR对COL-I、COL-IIIm RNA基因的表达量进行测定,并用以上测得数值进行统计学分析。5采用SYBR Green I染料法荧光定量PCR测定h TERT m RNA的表达情况及统计学分析按上述分组中Z组、Z+S组要求分别处理得到两组细胞,按方法4得到h TERT m RNA基因的表达量,并进行统计学分析结果:1 CCK-8的结果显示:1.1沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞增殖能力的影响:浓度为0(空白对照组)、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L组OD值分别为:1.1618±0.0783、0.898±0.0461、1.0761±0.0582、1.147±0.050,四个处理组的细胞活性不全相等(P0.05),组内比较结果显示:10-3、10-4mol/L浓度沙利度较0组相比,细胞增殖受到抑制(P0.05);10-5mol/L沙利度胺较0组比较,细胞增殖无明显差异(P0.05)。1.2沙利度胺对组胺诱导后人真皮成纤维细胞增殖活性的影响:K组、S组、Z组、Z+S组,各组OD值分别为:1.1618±0.0783、1.147±0.050、1.4182±0.0226、1.186±0.0515,四个处理组的细胞活性不全相等(P=0.000),组内比较结果示:Z组较K组细胞活性增强,两者之间差异有统计学意义(P0.05);Z+S组较Z组细胞活性受到抑制,两者之间差异有统计学(P0.05)结果提示:10-3mol/L、10-4mol/L浓度的沙利度胺可明显抑制正常成纤维细胞的增殖活性、100UM浓度的组胺可使人正常成纤维细胞增殖活性升高、10-5mol/L沙利度胺对正常细胞增殖活性无明显抑制作用,但对组胺激活后的成纤维细胞增殖活性有明显抑制作用。2沙利度胺对组胺诱导后成纤维细胞COL-I、COL-IIIm RNA的影响。K组、S组、Z组、Z+S组所得COL-Im RNARQ值分别为1.0157±0.0025、0.6577±0.0317、1.7693±0.0358、0.2557±0.0235。各组RQ值不全相等(P=0.000),组内比较结果示,S组较K组成纤维细胞COL-Im RNA RQ值降低,两者差异有统计学意义(P0.05),Z组较K组成纤维细胞COL-Im RNA RQ值明显升高,两者差异有统计学意义(P0.05);Z+S组较Z组相比COL-Im RNA RQ值降低,两者差异有统计学意义(P0.05),结果提示:100UM浓度的组胺可使正常人成纤维细胞COL-Im RNA表达升高,10-5mol/L浓度沙利度胺对正常成纤维细胞COL-Im RNA的表达存在抑制作用,但对组胺诱导后成纤维细胞的COL-Im RNA的表达抑制作用更明显。K组、S组、Z组、Z+S组所得COL-IIIm RNARQ值分别为:0.988±0.012、0.826±0.018、1.531±0.047、0.746±0.027,对所要研究比较的K组和Z组、K组和S组、Z+S组和Z组所得RQ值分别进行统计分析,Z组较K组COL-IIIm RNARQ值升高,两者有显著差异(P=0.001);S组较K组COL-IIIm RNARQ值降低,两者差异具有统计学意义(P=0.000);Z+S组较Z组COL-IIIm RNARQ降低,两者有显著差异(P=0.000),提示100UM浓度的组胺可使正常人成纤维细胞COL-IIIm RNA表达升高,10-5mol/L浓度沙利度胺对正常成纤维细胞COL-IIIm RNA的表达存在抑制作用,但对组胺诱导后成纤维细胞的COL-IIIm RNA的表达抑制作用更明显。3沙利度胺对组胺诱导后成纤维细胞h TERTm RNA的影响Z组、Z+S组所得h TERT m RNARQ值分别为:1.850±0.054、0.984±0.043,Z+S组较Z组h TERT m RNARQ值明显降低,差异具有统计学意义(P=0.000),提示沙利度胺对组胺诱导后成纤维细胞h TERT m RNA的表达有抑制作用。结论:1经浓度为100UM的组胺诱导后成纤维细胞增殖活性、COL-I、III m RNA的表达明显升高。2经组胺(100UM)活化后的成纤维细胞,在浓度为10-5mol/L沙利度胺的作用下,其细胞增殖活性、COL-I、III和h TERT m RNA的表达明显受到抑制。3该研究为沙利度胺应用于治疗病理性瘢痕的可能性以及更进一步的研究提供理论依据
【关键词】：沙利度胺 组胺 人真皮成纤维细胞 胶原蛋白I、III型、端粒酶mRNA 增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-22
• 结果22-25
• 附图25-28
• 附表28-31
• 讨论31-35
• 结论35-37
• 参考文献37-40
• 综述 端粒、端粒酶和皮肤科疾病40-51
• 参考文献48-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

【参考文献】

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  本文关键词：沙利度胺对组胺诱导后的人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、端粒酶mRNA的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：336160