替诺福韦酯致PC12细胞损伤及其机制研究

发布时间：2017-04-30 13:17

  本文关键词：替诺福韦酯致PC12细胞损伤及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:应用不同浓度替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)作用于体外培养PC12细胞(pheochromocytoma),观察替诺福韦酯对PC12细胞存活率、凋亡以及相关指标的影响,探讨替诺福韦酯对神经细胞损伤的作用机制。方法:MTT法检测PC12细胞的生存率;LDH法检测替诺福韦酯对PC12细胞的损伤作用;Hoechst-33342染色观察细胞核凋亡形态的变化;采用原位末端转移酶标记法(TUNEL)和Annexin V-FITC/PI标记染色流式细胞术检测PC12细胞凋亡率;酶标法测定PC12细胞内丙二醛(MDA)的含量;DCFH-DA染色法检测PC12细胞内活性氧(ROS)水平;Western-blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bax表达量的改变。结果:替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞存活率分别是100±3.07%、97.29±1.74%、99.08±1.54%、92.47±0.81%、81.86±2.53%和48.74±4.65%,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组降低,有统计学意义(P0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组降低,有显著性差异(P0.01),提示替诺福韦酯对PC12细胞生长抑制作用呈浓度依赖性。替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞培养液中LDH活性为118.84±17.88、137.87±26.06、144.85±25.26、189.58±24.98、214.51±22.30、262.86±21.71,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P0.01),提示替诺福韦酯对PC12细胞的损伤作用呈浓度依赖性。Hoechst-33342染色观察细胞核形态变化结果显示,随着替诺福韦酯浓度增高,显示凋亡特征的PC12细胞数量明显增加,呈现出不同程度的染色质凝聚,核皱缩和凋亡小体形成;TUNEL和Annexin V/PI标记染色流式细胞仪检测显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞凋亡率是1.21±0.45%、11.96±1.64%、33.60±5.87%和51.71±2.50%,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P0.05);当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P0.01),提示替诺福韦酯具有诱导PC12细胞凋亡作用。应用高内涵活细胞检测系统检测细胞内活性氧的含量变化,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞内ROS的荧光强度为25540.26±2584.27、37264.90±2098.7、68924.21±330.14和92540.88±4545.79,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P0.01);酶标法检测PC12细胞丙二醛含量的结果显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞内丙二醛含量分别为6.64±0.54、8.88±0.78、9.88±0.70和16.22±0.38,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P0.01);Western-blot检测结果显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞凋亡相关蛋白Bax相对表达量为1.14±0.04、1.28±0.04、1.61±0.06和2.19±0.07,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P0.01),提示替诺福韦酯致PC12细胞损伤与线粒体凋亡通路有关。结论:替诺福韦酯对PC12细胞具有损伤作用,与诱导PC12细胞凋亡有关;凋亡途径与线粒体凋亡通路有关。
【关键词】：替诺福韦酯 PC12细胞 细胞凋亡 氧化损伤
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 1 材料、试剂和仪器13-19
• 1.1 实验细胞株13
• 1.2 试剂13-14
• 1.3 仪器设备14-15
• 1.4 试剂配制15-19
• 1.4.1 DMEM细胞培养基15
• 1.4.2 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，，PBS）15
• 1.4.3 MTT工作液15
• 1.4.4 胰酶储备液15
• 1.4.5 胰酶工作液15
• 1.4.6 多聚赖氨酸工作液(PLL)15-16
• 1.4.7 PMSF配制16
• 1.4.8 考马斯亮蓝G250溶液16
• 1.4.9 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液16
• 1.4.10 10×电泳缓冲液16
• 1.4.11 1×转移缓冲液16
• 1.4.12 10×丽春红染液16
• 1.4.13 洗脱抗体缓冲液16-17
• 1.4.14 10×TBS缓冲液17
• 1.4.15 1×TBST缓冲液17
• 1.4.16 封闭缓冲液（5%的脱脂奶粉）17-19
• 2 实验方法19-25
• 2.1 PC12细胞培养19
• 2.2 MTT比色法检测替诺福韦酯对PC12细胞存活率的影响19
• 2.3 酶标法检测细胞培养液LDH的变化19
• 2.4 Hoechst-33342染色观察细胞核形态的变化19-20
• 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡率20
• 2.6 Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率20
• 2.7 高内涵成像系统检测PC12细胞内ROS的含量20
• 2.8 酶标法检测PC12细胞内丙二醛的含量20-21
• 2.9 Western-blot检测PC12细胞Bax的表达21-23
• 2.9.1 细胞总蛋白的提取21
• 2.9.2 BCA试剂盒定量检测细胞总蛋白浓度21-22
• 2.9.3 蛋白变性22
• 2.9.4 Western-blot检测22-23
• 2.10 统计学处理23-25
• 3 实验结果25-33
• 3.1 替诺福韦酯对PC12细胞增殖的影响25
• 3.2 LDH法检测替诺福韦酯对PC12细胞的损伤作用25-26
• 3.3 替诺福韦酯对PC12细胞核形态的影响26-27
• 3.4 Tunel法观察替诺福韦酯对PC12细胞凋亡率的影响27-28
• 3.5 Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测替诺福韦酯对PC12细胞凋亡的影响28-29
• 3.6 PC12细胞内ROS含量测定29-30
• 3.7 PC12细胞内丙二醛含量测定30
• 3.8 替诺福韦酯对PC12细胞凋亡蛋白Bax表达的影响30-33
• 4 讨论33-35
• 5 结论35-37
• 参考文献37-39
• 文献综述39-49
• 参考文献45-49
• 附录49-51
• 致谢51-53
• 攻读学位期间发表的学术论文53-54

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