利用CRISPR/Cas9文库在非小细胞肺癌中对奥西替尼耐药基因的筛选与鉴定研究

发布时间：2021-10-15 02:28

　　背景:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）在具有活性EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者中提供显著的抗肿瘤活性。第三代EGFR-TKI奥希替尼（Osimertinib）是为了克服EGFR-TKI最常见的耐药机制T790M位突变而开发的,临床反应有效率为59%⁷1%。但是随着时间的推移,作为第三代EGFR-TKI靶向抗肿瘤药物奥希替尼（Osimertinib）也不可避免的会产生耐药性,并且已经有文献报道了一些有关第三代EGFR-TKI耐药机制。尽管如此,目前为止我们对第三代EGFR-TKI获得性耐药机制并不完全了解,所以,高效快速的筛选出奥西替尼的潜在耐药基因,将会为第三代EGFR-TKI获得性耐药机制的进一步探明,新的靶向性药物的设计或是临床上联合使用靶向性药物治疗提供理论依据。目的:在非小细胞肺癌腺癌细胞NCI-H1975中筛选出奥希替尼的潜在耐药基因,并对筛选出的基因做进一步功能和机制的研究,为第三代EGFR-TKI获得性耐药机制... 

【文章来源】：河南科技大学河南省

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 非小细胞肺癌中耐药基因筛选的研究进展
    1.1 非小细胞肺癌概述
        1.1.1 非小细胞肺癌的流行病学统计结果
        1.1.2 肺腺癌的驱动基因
        1.1.3 EGFR-TKI的耐药性研究进展
    1.2 耐药基因的筛选
        1.2.1 CRISPR/Cas9 技术简介
        1.2.2 CRISPR/Cas9 高通量筛选流程
        1.2.3 CRISPR/Cas9 高通量筛选的研究进展
    1.3 筛选耐药基因的目的和意义
第2章 CRISPR/Cas9 全基因组文库的扩增及慢病毒包装
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒、菌株及细胞
        2.1.2 主要试剂与材料
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 GeCKOv2 libraries质粒的扩增
        2.2.2 GeCKOv2 libraries慢病毒的包装
    2.3 实验结果
        2.3.1 GeCKOv2 libraries文库质粒的扩增结果
        2.3.2 病毒滴度的测试结果
    2.4 实验讨论
第3章 Genome-scale CRISPR文库筛选奥西替尼耐药基因
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞及质粒
        3.1.2 主要试剂与材料
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 CCK-8 法测定奥西替尼的筛选浓度
        3.2.2 奥西替尼对潜在耐药基因的筛选(图3-1)
    3.3 实验结果
        3.3.1 奥西替尼的筛选浓度
        3.3.2 目的细胞的感染
        3.3.3 高通量测序的结果分析
    3.4 实验讨论
第4章 候选耐药基因FDX1 的功能鉴定
    4.1 实验材料
        4.1.1 细胞及质粒
        4.1.2 主要试剂与材料
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 克隆形成试验
        4.2.2 利用CRISPRlentiV2 构建目的质粒
        4.2.3 慢病毒包装与感染
        4.2.4 细胞的基因组提取及T载体连接
        4.2.5 CCK-8 法检测细胞存活
        4.2.6 Western Blot蛋白检测
        4.2.7 统计分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 建立敲除FDX1 表达的NCI-H1975 稳定细胞系
        4.3.2 敲除FDX1的H1975 细胞系c-PARP表达水平
        4.3.3 敲除FDX1的H1975 细胞系中EGFR及下游信号通路的抑制作用
        4.3.4 敲除FDX1对H1975 细胞克隆形成和细胞增殖的影响
    4.4 实验讨论
第5章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ 质粒图谱
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J]. 王梦瑶,杨亦农,边红武.  中国生物化学与分子生物学报. 2014(05)
[2]Growth factor receptors and related signalling pathways as targets for novel treatment strategies of hepatocellular cancer[J]. Michael Hpfner,Detlef Schuppan,Hans Scherübl.  World Journal of Gastroenterology. 2008(01)



本文编号：3437261