葡萄糖激酶的异源表达及葡萄糖激酶激动剂筛选体系的建立

发布时间：2021-10-17 11:02

　　目的葡萄糖激酶（GK）是治疗Ⅱ型糖尿病的重要靶标。旨在通过原核表达获得人源GK,并建立葡萄糖激酶激动剂（GKAs）分子筛选体系,用于筛选靶向GK的抗Ⅱ型糖尿病先导化合物。方法采用基因重组的方法构建GK原核重组表达载体GK-pET28a,将其转化入感受态细胞BL21（DE3）中,采用IPTG诱导重组蛋白的表达,且对诱导条件进行优化。使用Ni-NTA对融合蛋白进行分离纯化。通过Western-blot鉴定蛋白且通过双酶偶联法对蛋白酶进行活力测试。建立葡萄糖激酶激动剂分子筛选体系,筛选活性化合物,并通过表面等离子共振技术（SPR）和计算机分子模拟技术探究活性化合物与葡萄糖激酶的结合情况。结果通过基因重组将葡萄糖激酶与p ET28a原核表达载体构建成融合质粒,并且确定最佳诱导表达条件为:0.5 mmol·L^-1,37℃,4～5 h。最佳纯化条件为:含10 mmol·L^-1咪唑缓冲液洗杂蛋白,含100 mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。通过WesternBlot鉴定表达的蛋白为目的蛋白,且蛋白酶具有较高的活力。成功建立GKA... 

【文章来源】：中国海洋药物. 2020,39(05)CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

GK酶活检测原理

将GK-p ET28a重组质粒转化入表达菌株BL21(DE3）中，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导法诱导蛋白的表达，IPTG是1种极强的诱导剂，可以诱导表达载体中插入序列的蛋白翻译，且不被细胞代谢而十分稳定。本实验设置不同诱导条件对蛋白的表达进行优化（见图3），确定了最佳诱导条件为：诱导温度37℃，IPTG浓度为0.5 mmol·L-1，诱导时间为4～5 h。图3 不同诱导条件蛋白的表达

不同诱导条件蛋白的表达

【参考文献】：
期刊论文
[1]世界2型糖尿病新治疗剂开发应用最新进展[J]. 景倩,张钰.  黑龙江医药. 2019(03)
[2]新型降糖药物葡萄糖激酶激动剂治疗2型糖尿病[J]. 王福银,潘紫曜,李昌祁.  药品评价. 2016(01)
[3]以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病的实验研究进展[J]. 刘慧丽,席守民.  河南科技大学学报(医学版). 2014(04)



本文编号：3441651