以热休克蛋白为靶点的抗HBV药物研究

发布时间：2017-05-07 17:07

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种能通过反转录进行复制的小分子DNA病毒,它能感染宿主引起乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)疾病。HBV感染是世界性的公共健康问题,慢性感染会导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。目前,临床上治疗慢性乙病毒性肝炎的方式主要有两种:干扰素α的注射和核苷(酸)类似物如恩替卡韦、拉米夫定、阿地福韦等药物的服用,但是这两种方式都存在一些不足,如高剂量干扰素α存在宿主应答率低、副作用大等缺点,而核苷(酸)类似物药物容易引起耐药性及停药反弹等缺点,所以急需寻找新型的抗乙型肝炎病毒药物。热休克蛋白(Heat-shock proteins,HSPs)是细胞在应激状态下产生的一种伴侣蛋白,在HBV复制过程中,对反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA上的RNA包装信号(ε)的相互作用至关重要。KNK437能够通过影响热休克因子HSF和HSE的相互作用,来抑制热休克蛋白的mRNA和蛋白的积累,以及影响热休克蛋白在HeLa细胞、结肠癌、鳞状细胞癌和成胶质细胞瘤的培养细胞中诱导耐热功能。而且KNK437还能在杆状病毒感染周期中,抑制病毒颗粒的产生。但KNK437对乙肝病毒是否产生抑制作用,依然未知。本研究主要运用了三种肝癌细胞系模型:HepG2.215细胞系、瞬时转染1.1×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系。适当浓度的KNK437处理细胞后,用CCK-8的方法测定了药物的细胞毒性、酶联免疫法检测了表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌、荧光定量PCR的方法检测了细胞内HBV DNA和RNA水平的变化,最后还检测了KNK437对热休克蛋白的影响。研究结果表明20μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437能够抑制HBV HBsAg和HBeAg的分泌,并且能够大幅度下调细胞内HBV DNA和RNA水平,抑制HBV的复制和转录,实验也表明KNK437能够抑制热休克蛋白的表达。本研究说明KNK437能够在细胞水平抑制HBV的复制和转录,以及抗原蛋白的表达。核苷(酸)类似物药物作用机制都发生在HBV复制阶段,长期用药后容易发生突变。与其不同的是KNK437的作用靶点是细胞调节蛋白而非病毒本身,它可能作为一种新颖的靶向热休克蛋白的抗乙型肝炎病毒药物,具有较高的应用前景。
【关键词】：乙型肝炎病毒(HBV) 热休克蛋白(HSPs) KNK437 肝癌细胞系 抑制作用
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R978.7
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 引言9-23
• 1.1 HBV的概述9-13
• 1.1.1 HBV的分类学及基因分型9-10
• 1.1.2 HBV的结构和形态10-11
• 1.1.3 HBV基因组结构及蛋白产物11-13
• 1.2 HBV的生活周期13-17
• 1.2.1 病毒入侵宿主细胞14-15
• 1.2.2 双股DNA形成cccDNA15
• 1.2.3 病毒的转录与翻译15-16
• 1.2.4 核衣壳的组装与反转录16-17
• 1.2.5 病毒的分泌与释放17
• 1.3 乙型肝炎的治疗17-19
• 1.3.1 干扰素17-18
• 1.3.2 核苷（酸）类似物18-19
• 1.4 热休克蛋白19-20
• 1.4.1 热休克蛋白概述19-20
• 1.4.2 热休克蛋白与HBV反转录的作用20
• 1.5 KNK43720-22
• 1.5.1 KNK437概述20-21
• 1.5.2 KNK437生物功能21-22
• 1.6 本研究的目的、意义22-23
• 第2章 实验材料及方法23-42
• 2.1 实验材料23-31
• 2.1.1 实验细胞和质粒23-24
• 2.1.2 实验试剂及耗材24-27
• 2.1.3 实验仪器27-28
• 2.1.4 培养基及生化试剂的配制28-31
• 2.2 实验方法31-42
• 2.2.1 细胞培养及药物处理31
• 2.2.2 细胞转染31-32
• 2.2.3 细胞毒性实验32
• 2.2.4 细胞冻存32-33
• 2.2.5 胶原包被33
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备33
• 2.2.7 质粒DNA向大肠杆菌中转化及质粒提取33-34
• 2.2.8 ELISA检测细胞上清中HBsAg/HBeAg水平34-35
• 2.2.9 Bradford法测定蛋白浓度35-36
• 2.2.10 细胞内DNA提取36-37
• 2.2.11 SDS-PAGE37
• 2.2.12 Western Blot37-38
• 2.2.13 RNA的提取38
• 2.2.14 反转录实验38-39
• 2.2.15 荧光定量39-40
• 2.2.16 统计性分析40
• 2.2.17 实时定量PCR引物表40-42
• 第3章 结果与分析42-70
• 3.1 KNK437对HepG2.215细胞系和Huh7细胞系的细胞毒性42-44
• 3.1.1 KNK437对HepG2.215细胞系的细胞毒性42-43
• 3.1.2 KNK437对Huh7细胞系的细胞毒性43-44
• 3.1.3 小结44
• 3.2 KNK437对HBV的HBsAg和HBeAg水平的影响44-54
• 3.2.1 KNK437的浓度梯度处理后对HBsAg和HBeAg表达的影响45-49
• 3.2.2 KNK437的时间梯度处理后对HBsAg和HBeAg表达的影响49-54
• 3.2.3 小结54
• 3.3 KNK437对HBV DNA复制的影响54-60
• 3.3.1 KNK437的浓度梯度处理后对HBV DNA复制的影响55-57
• 3.3.2 KNK437的时间梯度处理后对HBV DNA复制的影响57-60
• 3.3.3 小结60
• 3.4 KNK437对HBV转录的影响60-65
• 3.4.1 KNK437的浓度梯度处理后对HBV RNA水平的影响60-63
• 3.4.2 KNK437的时间梯度处理后对HBV RNA复制的影响63-65
• 3.4.3 小结65
• 3.5 KNK437对热休克蛋白的转录的影响65-70
• 3.5.1 用荧光定量PCR检测KNK437对hsp70转录的影响66-67
• 3.5.2 用荧光定量PCR检测KNK437对hsp90b转录的影响67
• 3.5.3 用荧光定量PCR检测KNK437对hsp40转录的影响67-68
• 3.5.4 小结68-70
• 第4章 讨论70-73
• 参考文献73-81
• 致谢81-82
• 作者简历82

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本文编号：350244